多重免疫荧光结合空间图像分析，用于肿瘤微环境的临床和生物学评估

本协议中使用的所有样品均来自当地伦理委员会批准并经主管当局授权的研究。研究的所有参与者都提供了书面知情同意书。该试验已在 ClinicalTrials.gov 注册（NCT03608046）。 1. 多重免疫荧光 FFPE切片将组织固定在4%多聚甲醛中，并将固定组织嵌入石蜡中。 切割5μm切片，并将它们放在粘性显微镜载玻片上。 在室温（RT）下将载玻片干燥过夜。 脱蜡和内源性过氧化物酶抑制通过将载玻片浸入甲苯（每个3x，每个5分钟）和甲醇（每个3x，每个5分钟）中来脱蜡组织。 通过将载玻片浸入用甲醇稀释的3%过氧化氢中在通风橱下20分钟来抑制内源性过氧化物酶。 在蒸馏（d）H2O（1x中冲洗载玻片3分钟）。 多重免疫荧光染色将载玻片浸没在含有 10 mM 柠檬酸盐 （pH 6） 或 EDTA （pH 9） 缓冲液并补充有 0.1% TritonX-100 的 300 mL 染色罐中。注意：使用的缓冲液（pH 6或pH 9）取决于染色的抗原（见 表1）。 将染色罐盖在微波炉中以最大功率（例如，900 W）关闭3-5分钟，直到缓冲液开始沸腾。注意：煮沸的最佳时间取决于微波炉和缓冲液的体积。可能需要进行调整以找到完美的时机。对于一些脆弱的抗原或易碎且贴壁性较差的标本（例如类器官和球状体），微波煮沸可能过于苛刻。在这种情况下，可以使用压力锅代替。 通过将封闭的染色罐以低功率（例如90W）放入微波炉中15分钟，将缓冲液保持在接近沸腾的温度。 通过将微波炉置于最大功率90秒来执行加热的最后一步。 从微波炉中取出罐子，让缓冲液在室温下冷却15分钟。 在dH2O中冲洗载玻片3次，每次冲洗5分钟，在含有0.1%吐温20（TBS-T）的三缓冲盐水中冲洗1×5分钟。 通过在纸巾上吸干载玻片来取出TBS-T 将载玻片（平坦）放在染色室托盘或显微镜载玻片盒上（参见 材料表）。 用疏水笔包围组织。 通过用溶解在TBS-T中的5%牛血清白蛋白（BSA）覆盖组织30分钟来阻断非特异性结合位点。 通过在纸巾上吸干载玻片来去除封闭缓冲液。注意：阻塞步骤后不要冲洗载玻片。 用约300μL溶液覆盖组织，用1%BSA TBS-T稀释的一抗（参见 表1）孵育组织60分钟。 用TBS-T冲洗载玻片3次，每次3分钟。 用约300μL溶液覆盖组织，用poly-HRP二抗（见 表1）孵育组织40分钟。 用TBS-T冲洗载玻片3次3分钟。 用荧光染料酪胺试剂（参见表1）在硼酸盐缓冲液（0.1M硼酸盐，pH 7.8，3M NaCl）中稀释200倍，即席补充0.003%H 2 O2，用约300μL溶液覆盖组织，将组织孵育10分钟。 用TBS-T冲洗载玻片3次3分钟。 重复步骤1.3.1-1.3.16，直到完成所有TSA染色。 将组织在4°C下孵育过夜，最后一个一抗（参见表1）在 1%BSA TBS-T中稀释。注意：由于孵育是过夜的，因此重要的是要盖上染色室托盘或显微镜载玻片盒，并在盒子底部（载玻片下方）的纸巾上添加dH2O，以确保组织在孵育过程中不会干燥。 用TBS-T冲洗组织3次，每次5分钟。 将组织与在1%BSA TBS-T中稀释200倍的二抗（与荧光染料直接偶联）孵育120分钟。 用TBS-T冲洗组织3次，每次5分钟。 通过将组织在10%BSA TBS-T中稀释1，000倍的双苯甲酰亚胺（20mM）中孵育5分钟来染色细胞核。注意：双苯甲酰亚胺可以用DAPI代替，但后者毒性更大，必须在通风橱下小心处理。 在dH2O中冲洗组织3次，每次3分钟。 使用荧光安装介质和硼硅酸盐盖玻片安装载玻片。 2. 玻片扫描 通过在荧光载玻片扫描仪上以20倍放大倍率扫描载玻片来数字化载玻片（载玻片扫描仪的详细信息在 材料表中提供）。注意：最佳多路复用的代表性扫描如图 1所示。 3. 图像分析 将扫描导入图像分析软件（文件>打开图像）。 转到分类 器 选项卡，然后选择 DenseNet AI V2 插件。 训练 DenseNet AI V2 插件通过在一张图像中包围大约 500 个原子核来识别原子核。 通过围绕几张载玻片（约 10 张）上的多个细胞核 （50） 来训练来自同一批次的其他几张载玻片和不同批次的 mIF 染色的 AI。注意：有关如何使用 AI 插件的详细说明，请参阅软件手册。使用 AI 进行细胞核检测是可选的。根据所使用的图像分析软件，可以使用其他检测细胞核的方法。 保存经过训练的 AI（分类器操作>保存）。 转到“ 注释 ”选项卡，然后使用 “笔注释工具”为每个感兴趣区域 （ROI） 创建注释，例如肿瘤中心和肿瘤边缘。 如有必要，请使用“ 排除注释工具”删除具有褶皱的区域和看起来模糊的区域。注意：可以在mIF染色之前对与用于mIF的部分相邻的部分进行苏木精-伊红染色，以确保标本中存在肿瘤细胞并帮助解剖病理学家确定ROI。 转到 “分析 ”选项卡，然后选择 “HighPlex FL ”算法（>加载> HighPlex FL的设置操作）。 选择 “染料选择 ”选项卡，然后选择感兴趣的染料。 在 “核检测 ”选项卡中，转到“ 核分割类型”，然后选择“AI 自定义”。 在 “核分割分类器”中，选择在步骤 3.5 中保存的 AI。 在 “膜和 细胞质检测”选项卡中，选择最大细胞质半径（在本研究中，使用 1.5）和膜染料的数量。 对于每种染料，选择细胞核阳性阈值、细胞质阳性阈值和膜阳性阈值。注意：每种染色的阈值不同，应针对每批载玻片和每种抗原染色进行调整。使用“视图 设置 ”工具（“视图>视图设置”）可以帮助通过使用强度峰值末尾（右侧）的强度值来选择适当的阈值。 对于每种染料，选择细胞核、膜和细胞质的完整性百分比值。注意：当两个具有不同染色的细胞彼此靠近时，此参数对于避免假阳性检测非常重要（图2）。 保存算法（设置操作>保存）。 分析 ROI（分析>注释图层）。 转到 “结果 ”选项卡，然后选择 “对象数据 ”（ctrl + A） 中的所有数据。 以.csv格式导出数据（右键单击>导出>对象数据。Csv）。注意：此表包含位置（Xmin，Xmax;Ymin，Ymax）和每个分析细胞的每个标记物的阳性性。 4. 使用R的生物信息学 注意：GitHub 上提供了提供有关以下步骤的更多详细信息的 R 脚本（benidovskaya/Ring：用于分析多重免疫荧光染色的管道。[github.com]） 使用导出的表格，首先根据共定位染色定义不同的细胞类型。例如，通过双阳性 CD3+/CD8+ 细胞定义细胞毒性 T 细胞。 然后，使用从图像分析软件和ggplot2（图3).使用这些数据，可以执行多种类型的分析：密度分析注意：最简单的分析是密度分析。使用整个载玻片进行活检或组织的某些特定区域对所有细胞类型进行密度分析。例如，计算肿瘤中心和肿瘤边缘的CD3 +和CD8 + T细胞的密度（图4A-C）。 要计算这些密度，请使用图像分析软件为每个样品生成具有每个细胞表型和坐标的特定数据框。通过R上的聚类函数（k-最近邻），使用所研究的活检的边界创建一个多边形对象，并计算其内部感兴趣细胞类型的密度。注意：这允许比较不同条件（例如不同的时间点，治疗类型，组织类型和对治疗的反应）和定位（肿瘤中心，肿瘤边缘，基质纤维化和坏死区域）之间不同细胞类型的密度取决于生物学假设。由于癌细胞、肿瘤周围细胞和肿瘤浸润细胞之间的高度接近，图像分析软件可以同时将双阳性细胞检测为免疫细胞和癌细胞。在这种情况下，人们需要通过提及这些双阳性细胞是什么来生物信息学地纠正这个问题。在这种情况下，CD3 + CD8 + 细胞角蛋白+细胞被标记为细胞毒性细胞，因为细胞角蛋白阳性是由于浸润淋巴细胞周围的肿瘤细胞。 热图使用来自不同面板的每种细胞类型的密度并应用归一化（例如，缩放居中），绘制表示样品群中细胞丰度的热图（图5）。 使用基于细胞密度的分层无监督聚类，对具有相似TME组成的患者进行聚类，并将这些聚类与临床参数（如治疗反应和生存）相关联。注意：热图和聚类可以使用 R ComplexHeatmap 包9 轻松执行。 空间像元分布以生物信息学方式计算细胞（例如，免疫细胞和肿瘤细胞; 图6A，B）基于图像提供的细胞坐标进行分析。使用感兴趣的细胞类型之间的中位数和平均距离来比较队列中所有样本的细胞邻近性。 空间描述函数使用通过R spatstat包10提供的十字型最近邻G-cross函数来确定感兴趣的细胞X（例如肿瘤细胞）在细胞X周围的一定半径内遇到最近的细胞Y（例如T细胞）的概率。 计算经验曲线下的面积，以获得表示肿瘤细胞11 周围CD3 + T细胞肿瘤浸润的数值（图6C）。使用其他空间描述函数，例如 F 函数或 J 函数12。 免疫评分分析计算由Galon7，8团队开发的免疫评分（I），通过使用肿瘤中心的CD3 +和CD8 + T细胞的密度以及肿瘤的侵袭性边缘。注意：分数范围从 I0 到 I4。肿瘤中心和边缘的CD3+和CD8 + T细胞密度低与I0评分相关，而两个区域的CD3 +和CD8 + T细胞密度均与I4评分相关。最近，Immunocore的预后影响在一项研究中得到了验证，该研究对来自13个国家14个中心的2，681名I-III期结肠癌患者的样本进行了验证7。然而，要计算，免疫评分需要一个包含肿瘤中心和边缘的手术切除标本。对于通常没有边缘的活检，最近开发了适应活检的免疫评分13。 要计算活检适应免疫评分，请将 CD3+ 和 CD8+ T 细胞密度的值转换为百分位数，然后使用 CD3+ 和 CD8+ T 细胞的平均百分位数评分分为三类（即低、中和高）之一13。 热点分析通过使用四边形计数函数（spatstat）10，使用热点分析来比较组织浸润最多区域中不同细胞类型的密度。例如，可以使用组织浸润最多的方块的CD3和CD8 T细胞密度值来计算“类似免疫评分”评分（图7）。将该方法应用于分析组织中分布不均匀的任何细胞类型。