Summary

MouseWalkerを用いた脊髄損傷マウスモデルにおける自発運動機能障害の定量化

Published: March 24, 2023
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Summary

MouseWalker(MW)ツールボックスを使用して自由に歩くマウスの自発運動パターンを定量的に記述するための実験パイプラインが提供されており、初期のビデオ録画や追跡から定量化後の分析まで、さまざまな結果が得られています。マウスの脊髄挫傷損傷モデルを用いて、MWシステムの有用性を実証した。

Abstract

ウォーキングやランニングなどの複雑で高度に調整された運動プログラムの実行は、脊髄回路および脊髄上回路のリズミカルな活性化に依存しています。胸部脊髄損傷後、上流回路との通信が損なわれます。これは、順番に、限られた回復の可能性で、調整の喪失につながります。したがって、薬物または治療法の投与後の回復の程度をよりよく評価するためには、脊髄損傷の動物モデルにおける歩行、四肢協調、およびその他の自発運動行動の細かい側面を定量化するための、より詳細で正確な新しいツールが必要です。げっ歯類の自由歩行行動を定量的に評価するために、いくつかのアッセイが長年にわたって開発されてきました。ただし、通常、ステップ歩行戦略、フットプリントパターン、および調整に関連する直接的な測定値が不足しています。これらの欠点に対処するために、フラストレーション全反射(fTIR)通路と追跡および定量化ソフトウェアを組み合わせたMouseWalkerの更新バージョンが提供されています。このオープンソースシステムは、いくつかのグラフィカル出力と運動学的パラメータを抽出するように適合されており、一連の定量化後ツールを使用して、提供された出力データを分析できます。この原稿はまた、この方法がすでに確立された行動テストと組み合わせて、脊髄損傷後の自発運動障害を定量的に記述する方法を示しています。

Introduction

四肢の効果的な調整は、四足動物に固有のものではありません。人間の前肢と後肢の協調は、水泳や歩行中の速度の変化など、いくつかのタスクを実行するために依然として重要です1。さまざまな四肢運動学2と運動プログラム1,3,4および固有受容感覚フィードバック回路5は、ヒトと他の哺乳類の間で保存されており、脊髄損傷(SCI)などの運動障害の治療オプションを分析する際に考慮する必要があります6,7,8

歩くためには、前肢と後肢からのいくつかの脊椎接続が適切に配線され、リズミカルに活性化される必要があり、これには脳からの入力と体性感覚系からのフィードバックが必要です2,9,10これらの接続は、それぞれ前肢と後肢の頸部と腰部のレベルに位置する中央パターンジェネレーター(CPG)で最高潮に達します1,9,10多くの場合、SCI後、ニューロンの接続性の破壊と抑制性グリア瘢痕12の形成は、自発運動機能の回復を制限し、結果は、損傷の重症度に応じて、完全な麻痺から四肢のグループの機能の制限までさまざまです。SCI後の自発運動機能を正確に定量化するツールは、回復を監視し、治療やその他の臨床介入の効果を評価するために重要です6。

SCIのマウス挫傷モデルの標準的なメトリックアッセイは、バッソマウススケール(BMS)13,14であり、オープンフィールドアリーナでの体幹の安定性、尾の位置、足底のステッピング、および前肢と後肢の協調を考慮したノンパラメトリックスコアです。BMSはほとんどの場合非常に信頼性が高いですが、自然な変動性を説明し、バイアスを減らすために、動物の動きのすべての角度を観察するには、少なくとも2人の経験豊富な評価者が必要です。

SCI後の運動性能を定量的に評価するために、他のアッセイも開発されています。これらには、回転シリンダー15に費やされた時間を測定するロタロッドテストが含まれます。手すりの欠落と正のはしごの数を測定する水平はしごは16,17。ビーム歩行テストは、動物が狭いビーム18を横切るときにかかる時間と失敗の数を測定します。運動障害の組み合わせを反映しているにもかかわらず、これらのテストのいずれも、前肢と後肢の協調に関する直接的な自発運動情報を生成しません。

歩行行動を具体的かつより徹底的に分析するために、ステップサイクルと歩行戦略を再構築するための他のアッセイが開発されています。一例は、動物のインクを塗った足が白い紙19のシートの上にパターンを描くフットプリントテストです。実行は簡単ですが、ストライド長などの運動学的パラメータを抽出するのは面倒で不正確です。さらに、ステップサイクルの持続時間や脚時調整などの動的パラメータの欠如は、そのアプリケーションを制限します。実際、これらの動的パラメータは、透明な表面を歩くげっ歯類のフレームごとのビデオを分析することによってのみ取得できます。SCI研究では、研究者は、ステップサイクルの再構築や各脚関節の角度変動の測定など、トレッドミルを使用して側面から歩行行動を分析しました4,20,21このアプローチは非常に有益ですが6、特定の手足のセットに焦点を当てたままであり、調整などの追加の歩行機能が欠けています。

これらのギャップを埋めるために、Hamersたちは、フラストレーション全反射(fTIR)22を用いた光学式タッチセンサーに基づく定量的試験を開発した。この方式では、光は内部反射 によって ガラス中を伝搬し、足を押すと散乱し、最終的に高速度カメラで撮影されます。より最近では、MouseWalkerと呼ばれるこの方法のオープンソースバージョンが利用可能になり、このアプローチは、fTIR通路と追跡および定量化ソフトウェアパッケージとを組み合わせたものである23。この方法を使用して、ユーザは、歩調、空間、および歩行パターン、足跡の位置、および前肢−後肢協調、ならびに足跡パターン(インク付き足場アッセイ6を模倣する)または体軸に対する立脚位相などの視覚的出力を含む、定量的パラメータの大規模なセットを抽出することができる。重要なのは、そのオープンソースの性質により、MATLABスクリプトパッケージを更新することで新しいパラメーターを抽出できることです。

ここでは、以前に公開されたMouseWalker23 システムのアセンブリが更新されます。設定方法の説明と、最高のビデオ品質、トラッキング条件、およびパラメータ取得を実現するために必要なすべての手順が記載されています。マウスウォーカー(MW)出力データセットの分析を強化するために、追加の定量化後ツールも共有されています。最後に、このツールの有用性は、脊髄損傷(SCI)のコンテキストで、一般的な自発運動能力、特にステップサイクルと前肢と後肢の協調の定量化可能な値を取得することによって実証されます。

Protocol

すべての取り扱い、外科的、および術後のケア手順は、ライセンス0421/000/000/2022に基づく欧州共同体ガイドライン(指令2010/63 / EU)およびポルトガルの動物管理に関する法律(DL 113/2013)に従って、Instituto de Medicina分子内部委員会(ORBEA)およびポルトガル動物倫理委員会(DGAV)によって承認されました。本研究では、9週齢の雌C57Bl/6Jマウスを用いた。動物の数を最小限に抑え、研究に使用された動物の?…

Representative Results

標準BMSシステムは、SCI14以降の総運動赤字を説明しています。その主観的な性質のために、他の定量的アッセイは一般にBMSと一緒に実行され、移動のより詳細で詳細な評価を生成します。しかし、これらのテストでは、脊髄回路がどのように機能を維持し、不完全なSCIに適応するかを理解する上で非常に重要な、ステップサイクル、ステッピングパターン、および前肢と後?…

Discussion

ここでは、SCI後の自発運動行動を解析することにより、マウスウォーカー法の可能性を実証します。これは、他の標準的なテストでは見逃されるステップ、フットプリント、および歩行パターンの特定の変化に関する新しい洞察を提供します。MW パッケージの更新バージョンを提供するだけでなく、提供されている Python スクリプトを使用してデータ分析ツールについても説明します (手順 5 …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、ローラ・タッカーとナタサ・ロンカレビッチの原稿に対するコメントと、メディチーナ分子ジョアン・ロボ・アントゥネス研究所のげっ歯類施設による支援に感謝します。著者らは、プレミオスサンタカーサニューロシエンシアス-脊髄損傷研究のための賞メロエカストロ(MC-36 / 2020)からL.S.およびC.S.M.への財政的支援に感謝したいと思います。本研究は、Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020)、iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 および UIDP/04462/2020)、および LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) から C.S.M. L.S. への支援は、CEEC個人主任研究者契約(2021.02253.CEECIND)の支援を受けた。A.F.I.は、FCT(2020.08168.BD)の博士課程のフェローシップによってサポートされました。AMMは、FCTの博士フェローシップ(PD / BD / 128445 / 2017)によってサポートされました。IMは、FCTのポスドクフェローシップ(SFRH/BPD/118051/2016)の支援を受けました。D.N.S.は、FCTの博士研究員(SFRH/BD/138636/2018)の支援を受けました。

Materials

45º Mirror 
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side Misumi
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side Misumi
1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long Misumi
87 x 23 cm mirror General glass supplier 
black cardboard filler  General stationery supplier We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror
Background backlight
109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side Misumi
multicolor LED strip General hardware supplier
white opaque paper to cover the plexyglass General stationery supplier
fTIR Support base and posts
2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height Misumi
60 x 30 cm metric breadboard Edmund Optics  #54-641
M6 12 mm screws Edmund Optics 
M6 hex nuts and wahers Edmund Optics 
fTIR Walkway 
109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) General hardware supplier 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)
109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side Misumi
black cardboard filler  General stationery supplier we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges
12 mm screws Edmund Optics  M6
High speed camera (on a tripod)
Blackfly S USB3 Blackfly USB3 This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second
Infinite Horizon Impactor 
Infinite Horizon Impactor  Precision Systems and Instrumentation, LLC.
Lens
Nikkon AF Zoom-Nikkor 24-85mm Nikkon  2.8-4D IF This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals
Software
MATLAB R2022b MathWorks
Python 3.9.13  Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4 Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5  Spyder Project Contributors
Walkway wall 
2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm Any bricolage convenience store
2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height Any bricolage convenience store
GitHub Materials
Folder name URL
Boxplots https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots Script to create Boxplots
Docs https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs Additional documents
Heatmap https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps Script to create heatmap
Matlat script https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script MouseWalker matlab script
PCA https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots Script to perform Principal Component Analysis
Raw data Plots https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots Script to create Raw data plots
Residual Analysis https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis Code to compute residuals from Raw data

Referências

  1. Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
  2. Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
  3. Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
  4. Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
  5. Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a ‘simple’ stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
  6. Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
  7. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  8. Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
  9. Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
  10. Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
  11. Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
  12. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
  13. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  14. Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  15. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
  16. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
  17. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  18. Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
  19. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  20. Leblond, H., L’espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
  21. Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
  22. Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  23. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
  26. Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
  27. Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
  28. Bishop, C. M. . Pattern Recognition and Machine Learning. , (2006).
  29. vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. . Dimensionality reduction: A comparative review. , (2009).
  30. Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
  31. Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
  32. Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
  33. Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
  34. Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
  35. Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
  36. Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).
check_url/pt/65207?article_type=t

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Citar este artigo
Isidro, A. F., Medeiros, A. M., Martins, I., Neves-Silva, D., Saúde, L., Mendes, C. S. Using the MouseWalker to Quantify Locomotor Dysfunction in a Mouse Model of Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (193), e65207, doi:10.3791/65207 (2023).

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