麻酔マウスにおける頭蓋外刺激電極の配置と脳血流および頭蓋内電界の測定
Summary
頭蓋外刺激の用量反応曲線を脳電界測定と関連するバイオマーカー-脳血流の観点から評価するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは脳への侵襲的な電極の配置を含むので、全身麻酔が、制御された呼吸よりもむしろ自発呼吸が好まれる必要である。
Abstract
さまざまな形態のニューロンの活性化に対する脳血流(CBF)応答の検出は、動的な脳機能と脳への基質供給の変動を理解するために重要です。この論文では、経頭蓋交流刺激(tACS)に対するCBF応答を測定するためのプロトコルについて説明します。線量反応曲線は、tACS(mA)で発生するCBFの変化と頭蓋内電界(mV / mm)の両方から推定されます。.頭蓋内電界は、脳の両側にあるガラス微小電極によって測定された異なる振幅に基づいて推定されます。この論文では、両側レーザードップラー(LD)プローブまたはレーザースペックルイメージング(LSI)を使用してCBFを測定する実験セットアップについて説明します。その結果、このセットアップでは、電極の配置と安定性のために麻酔が必要です。CBF応答と電流の相関関係を年齢の関数として提示し、高齢の動物(28〜32週)と比較して、若い対照動物(12〜14週)の高電流(1.5mAおよび2.0mA)で有意に大きな応答を示しました(p <0.005差)。また、電界強度<5 mV/mmで有意なCBF応答を示しており、これは最終的なヒト研究にとって重要な考慮事項です。これらのCBF反応は、覚醒動物と比較した麻酔の使用、呼吸制御(すなわち、挿管呼吸と自発呼吸)、全身的要因(すなわち、CO2)、および周皮細胞および内皮細胞によって媒介される血管内の局所伝導によっても強く影響を受ける。同様に、より詳細なイメージング/記録技術により、脳全体からの視野サイズを小さな領域のみに制限する可能性があります。げっ歯類用の自家製電極と市販電極の両方の設計、両側ガラスDC記録電極を使用したCBFと頭蓋内電界の同時測定、およびイメージングアプローチを含む、tACS刺激を適用するための頭蓋外電極の使用について説明します。現在、これらの技術を応用して、アルツハイマー病や脳卒中の動物モデルでCBFを増強するためのクローズドループフォーマットを実装しています。
Introduction
経頭蓋電気刺激(tES;正弦波刺激を伴う、tACS)は、脳の神経調節に対する一般的な外部非侵襲的アプローチです1,2。以前、特定の用量で、tES(特にtACS)が下にある脳領域の脳血流(CBF)を増加させる可能性があるという仮説を立てました3。さらに、線量反応関係は、印加された外部電流または頭蓋内電界のいずれかと、結果として生じるCBF応答との間に存在し得る。ただし、ほとんどの臨床刺激プロトコルは、治療プロトコルとして、予定された期間(つまり、30〜45分)の最大快適な皮膚レベルの刺激(つまり、~2 mA)に焦点を当てています4,5。げっ歯類では、頭蓋骨に直接適用された侵襲的な頭蓋外脳電極を使用して、tES6によって誘導される脳内の電界を調べることができます。したがって、このアプローチの目標は、用量反応関係の観点から、関連する周波数でのtACSの強度がCBFの変化に及ぼす影響を決定することです。この線量反応曲線は、脳に課せられた電界に関連するCBFの短期生理学的バイオマーカー直接測定に基づいている3。我々は以前、tACSによって臨床的に誘導される脳内の電界の範囲を典型的に超える、より大きな振幅で、誘導された電界と皮質のCBFとの間にほぼ線形の相関関係があることを示した3。ただし、より小さな磁場刺激(すなわち、1〜5 mV / mmの強度)は、ヒトでの使用により適切で実行可能な場合があります。そのため、より小さなCBFの変化を検出するように手法を変更しました。
この論文では、覚醒したげっ歯類が許容できるCBF(すなわち、0.5-2.0mA電流、1-5mV / mm電界)に対する低電界強度tES交流正弦波(tACS)の影響を分析するためのプロトコルについて説明します5。このプロトコルは、tACS中の新しいレーザースペックルイメージング、およびデュアル頭蓋内ガラス電極を使用して、脳内のアクティブなtACSの広がり(CBFによって監視される)と、図と実際の実験写真(図1)の両方として示されている頭蓋内電界強度の両方を決定します。脳内のtESには、直接的な神経細胞の変調、神経可塑性、アストロサイトの活性化など、多くの生理学的影響が考えられます7,8。CBFはtDCS 9,10で測定されているが、これらの測定は遅く、間接的であり、脳の線量反応機能を評価するには不十分であった。したがって、適切な短期バイオマーカー(CBF、電界など)とtACSの高速オン/オフシーケンスを用いることで、より正確に線量反応関数を推定できるようになりました。さらに、焦点レーザードップラープローブ(LD)とレーザースペックルイメージング(LSI)の両方を含む、CBFの測定には、関心領域が定義されたさまざまな手法を適用できます。
図1:経頭蓋刺激図と写真例。 (A)経頭蓋刺激セットアップの図。この図は、冠状縫合糸と矢状縫合糸を備えたマウスの頭蓋骨を示しています。経頭蓋電極は、頭蓋骨に横方向および対称的に配置され、電極と頭蓋骨の間に外科用接着剤と導電性ペーストで取り付けられます。これらの電極は、人間と互換性のある定電流刺激デバイスに接続され、刺激の周波数、振幅、および持続時間を指定できます。頭蓋内電界の評価のために、両側ガラス電極(~2MΩ)を大脳皮質(すなわち、頭蓋骨の内側から小さなバリ穴を通して1mm以内)に配置し、これらを鉱物油で密封し、頸部筋にAgCl接地を有する(皮下頸部組織に埋め込まれた中央の太いワイヤーとして示されている)。これらのガラス電極はDCアンプに接続され、その出力は少なくとも4つのチャネルを備えたデジタイザを介して記録されます。また、両側レーザードップラープローブを頭蓋骨に装着して記録します。頭蓋骨全体は、レーザースペックルイメージングデバイスまたは高解像度(少なくとも1,024 x 1,024ピクセル、12〜14ビットピクセル深度)の冷却カメラで画像化され、固有の光信号を検出します。ヘモグロビン等石酸周波数は、通常、血流イメージング用の照明用に選択されます(すなわち、562 nm)。(B)実際の実験のクローズアップ画像で、両側レーザードップラープローブ(左)、バリ穴から配置された(両側の)頭蓋内ガラス記録微小電極、およびtACS刺激電極を横方向に示す。略語:tACS =経頭蓋交流刺激。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
メカニズムを評価する方法として、K+誘導拡散脱分極など、CBFを変化させる他の生理学的プロセスとの相互作用を調べることもできます11。さらに、定期的に予定されたセッションではなく、てんかん治療12 (すなわち、臨床用ニューロペースデバイス)について提案されているように、様々な疾患に対する追加のバイオマーカーに基づくクローズドループシステムを開発することも可能である。例えば、パーキンソン病の閉ループ脳刺激は、通常、十分なドーパミン(典型的にはβバンドLFP)がない場合に、この疾患に内在する固有の異常な局所電界電位(LFP)に基づいている13。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルはtES14への頭脳の応答を推定するbiomarkerとして生体内の生体内の、CBFの応答の麻酔をかけられた測定に焦点を合わせる。tES反応の長期的なバイオマーカーには、アミロイドプラーク形成の予防や変化(すなわち、いくつかのADモデルでは40Hzでのガンマ線刺激)などの組織学的治療効果が含まれます16,17,18,19</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIA RO1 AG074999、NIA R21AG051103、VA I21RX002223、およびVA I21 BX003023の助成金(D.A.T.への)によって支援されました。
Materials
| Alcohol pads | HenryShein | 112-6131 | |
| Baby mineral oil | Johnson & Johnson | ||
| BD 1 mL syringe | Becton Dikinson | REF 305699 | |
| C3 Flat Surface Electrodes | Neuronexus | ||
| C57BI mice | from NIH colonies | ||
| Copper skull electrods | In house preparation | ||
| Digidata 1440, Clampex | Axon Instruments | ||
| Dumont #5 forceps | FST | #5 | |
| Dumont #7 forceps curved | Dumont | RS-5047 | |
| Eye ointment | Major | LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter instrument Co. | Model P-87 | |
| Forceps 11.5 cm slight curve serrated | Roboz | RS-8254 | |
| Intramedic needle 23 G | Becton Dikinson | REF 427565 | |
| KCl 1 M | In house preparation | ||
| Laser Doppler Probes | Moor Instruments | 0.46 mm laser doppler probes | |
| Laser Speckle Imaging Device | RWD | RFLSI-ZW | |
| Micro curette 13 cm | FST | 10080-05 | |
| Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm | Roboz | RS-5914 | |
| Mouse anesthesia fixation | Stoelting | ||
| Neuroconn-DS | Neurocare | DC-Stimulator Plus | |
| PhysioSuite Monitoring | Kent Scientific | ||
| Q-tips | Fisherbrand | 22363167 | |
| Saline 0.9% NaCl solution | Baxter | 281322 | |
| Sensicam QE | PCO Instruments | ||
| Software | Axon Instruments Clampex | ||
| Surgical glue | Covetrus | 31477 | |
| Surgical tape | 3M Transpore | T9784 |
Referências
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