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Biologia

Dispositivo de infusión directa para la administración de moléculas en plantas

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/65194
, , , , , ,
1United States Department of Agriculture Agricultural Research Service U.S. Horticultural Research Laboratory, 2Agrosource Incorporated

Summary

Este manuscrito describe un novedoso dispositivo de infusión directa de plantas para evaluar la efectividad de moléculas contra la bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) o su insecto vector (Diaphorina citri, Kuwayama) que, en combinación, están asociadas con la enfermedad de los cítricos de Huanglongbing.

Abstract

Probar la función de los compuestos terapéuticos en las plantas es un componente importante de la investigación agrícola. Los métodos foliares y empapados de suelo son rutinarios pero tienen inconvenientes, incluida la absorción variable y la descomposición ambiental de las moléculas probadas. La inyección de troncos de árboles está bien establecida, pero la mayoría de los métodos para esto requieren equipos costosos y patentados. Para evaluar varios tratamientos para Huanglongbing, se necesita un método simple y de bajo costo para administrar estos compuestos al tejido vascular de pequeños árboles de cítricos cultivados en invernadero infectados con la bacteria limitada por floema Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) o infestados con el insecto vector CLas que se alimenta de floemas Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).

Para cumplir con estos requisitos de cribado, se diseñó un dispositivo de infusión directa de plantas (DPI) que se conecta al tronco de la planta. El dispositivo se fabrica utilizando un sistema de impresión 3D basado en nylon y componentes auxiliares fáciles de obtener. La eficacia de absorción del compuesto de este dispositivo se probó en plantas de cítricos utilizando el marcador fluorescente 5,6-carboxifluoresceína-diacetato. La distribución uniforme del marcador en todas las plantas se observó rutinariamente.

Además, este dispositivo se utilizó para administrar moléculas antimicrobianas e insecticidas para determinar sus efectos sobre CLas y D. citri respectivamente. El antibiótico aminoglucósido estreptomicina se administró en plantas de cítricos infectadas con CLas utilizando el dispositivo, lo que resultó en una reducción en el título de CLas de 2 semanas a 4 semanas después del tratamiento. La administración del insecticida neonicotinoide imidacloprid en plantas de cítricos infestadas de D. citri resultó en un aumento significativo en la mortalidad de psílidos después de 7 días. Estos resultados sugieren que este dispositivo DPI representa un sistema útil para entregar moléculas a las plantas para pruebas y facilitar la investigación y la detección.

Introduction

El manejo de plantas en entornos comerciales y paisajísticos a menudo requiere el uso de compuestos químicos para optimizar el crecimiento y la salud de las plantas. La forma en que se entregan estas moléculas depende del tipo de molécula, la función de la molécula, el tipo de planta y el sistema de manejo establecido. Las aplicaciones foliares y de suelo son las estrategias de entrega más fáciles, pero las limitaciones en la absorción de algunas moléculas requieren la entrega directa. Un ejemplo de estas moléculas son las moléculas terapéuticas que funcionan mejor cuando se mueven sistémicamente dentro de la planta, pero no pueden ser entregadas eficazmente por aplicaciones tópicas simples1. Este es el caso de Huanglongbing (HLB), también llamado enfermedad del enverdecimiento de los cítricos. El HLB es una enfermedad asociada con una bacteria limitada por floema, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), que no puede cultivarse fuera de la planta, o su insecto vector, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.

Si las moléculas terapéuticas putativas son productos genéticos, pueden probarse creando plantas transgénicas que expresen estos compuestos. Sin embargo, la producción de plantas transgénicas puede requerir mucho tiempo y recursos, depende en gran medida del genotipo y puede inhibirse mediante el silenciamiento génico3. Además, incluso si estos transgénicos muestran resultados prometedores, las restricciones regulatorias y de percepción pública reducen la probabilidad de su aceptación comercial 4,5. La aplicación exógena de compuestos, sin embargo, simplifica la prueba de moléculas biológicas y sintéticas porque no requiere la producción de plantas transgénicas estables o que expresen transitoriamente, lo que reduce el tiempo y los recursos para probar los efectos de una molécula. Un método para la entrega sistémica efectiva y eficiente de compuestos exógenos a plantas podría usarse para una amplia variedad de propósitos de investigación y detección.

Una de estas aplicaciones es el análisis del movimiento sistémico de moléculas dentro del sistema vascular de una planta, que se puede hacer utilizando marcadores rastreables, ya sean isótopos químicos fluorescentes, visibles o únicos 6,7,8,9. Un marcador fluorescente comúnmente utilizado es el 5,6-carboxifluoresceína-diacetato (CFDA), que es un colorante permeable a la membrana que es degradado por esterasas intracelulares en 5,6-carboxifluoresceína (CF) y, posteriormente, se vuelve fluorescente e impermeable a la membrana10. El CFDA se ha utilizado ampliamente para monitorear el transporte del floema, las relaciones entre el sumidero y la fuente, y el patrón de vasculatura en el tejido vegetal11,12.

Además de estos marcadores, ciertos compuestos pueden alterar directamente la fisiología de la planta para aumentar la productividad o matar a la planta en el caso de los herbicidas. Tanto los insecticidas como los compuestos antimicrobianos son un medio para aumentar la productividad de las plantas, especialmente en presencia de HLB. Un ejemplo de una molécula antimicrobiana que se utiliza para controlar CLas es la estreptomicina. La estreptomicina es un antibiótico aminoglucósido que fue aislado originalmente de Streptomyces griseus y se ha demostrado que inhibe el crecimiento bacteriano a través de la inhibición de la biosíntesis de proteínas13. En términos de insecticidas, el objetivo principal de la investigación del HLB es D. citri, que transmite CLas de árbol a árbol14. Para este propósito, los neonicotinoides, como el imidacloprid, son comúnmente utilizados, ya que son el estándar de oro para el control de plagas de insectos15. Todos estos usos variados son aspectos importantes de las estrategias actuales de gestión de la planta, y el desarrollo de nuevos productos depende de ensayos de detección eficientes.

Un método que se utiliza para la introducción de compuestos en plantas leñosas es la inyección directa en el tronco. Se han diseñado una variedad de sistemas que varían en sus necesidades para sitios de inyección preperforados, y estos sistemas utilizan inyección basada en presión o flujo pasivo16. Aunque los sistemas basados en la presión permiten la introducción rápida de un compuesto dado, el daño físico potencial causado por forzar el líquido a través de la vasculatura bloqueada o embolizada debe considerarse17. Aunque la aplicación foliar o empapada de compuestos requiere menos tiempo de implementación, la inyección directa en la planta reduce el desperdicio del compuesto de interés debido a pérdidas en el aire o el suelo y también puede alargar el tiempo que los compuestos están en estado activo al reducir la exposición al ambiente exterior18. Ambos aspectos son importantes para preservar los reactivos costosos y garantizar la coherencia entre las réplicas en entornos de investigación.

Este estudio describe el diseño, la construcción y el uso de un innovador dispositivo de infusión directa de plantas (DPI), que se puede utilizar para evaluar cómo los compuestos de interés afectan a una planta huésped. Se utilizó una impresora 3D estándar para fabricar tanto el dispositivo en sí como varios componentes asociados con su construcción. Este método de construcción interno permite a los investigadores modificar el dispositivo y los componentes del dispositivo en función de sus necesidades experimentales específicas y reduce la dependencia de los dispositivos de inyección de planta disponibles comercialmente. La configuración del dispositivo es simple y eficiente, y todos los componentes auxiliares están disponibles y son económicos. Aunque el sistema fue diseñado para su uso con una variedad de especies de plantas, los ejemplos presentados aquí pertenecen a plantas de cítricos en macetas. Además, este estudio demuestra que este dispositivo es capaz de entregar de manera eficiente múltiples tipos de compuestos sistémicamente a las plantas jóvenes de cítricos sin causar letalidad. Los compuestos probados incluyeron CFDA, que se utilizó para evaluar la distribución del compuesto en la planta, y estreptomicina e imidacloprid, que se utilizaron para verificar que los efectos antimicrobianos e insecticidas de estos compuestos se observaron cuando se administraron a través de DPI.

Protocol

1. Producción de plantas de cítricos para inyección experimental de compuestos Propague pequeños árboles de cítricos en macetas a partir de esquejes vegetativos enraizados o semillas. Cultivar las líneas de cítricos en maceta bajo una duración de día claro/oscuro de 16 h/8 h y a 28 °C. Seleccione plantas de cítricos del tamaño apropiado para el experimento. Las aplicaciones descritas requerían que las plantas tuvieran entre 12 cm y 100 cm de altura con diámetros de tronco de 4-14 mm. Si se requiere un nuevo crecimiento al ras, corte las plantas antes del experimento. 2. Impresión tridimensional del dispositivo DPI y componentes del molde Aplique una capa delgada de pegamento a base de acetato de polivinilo a la cama de impresión. Cargue filamento de nylon en la impresora 3D y prepare la impresora de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Importe el archivo . STL (Archivo complementario 1, Expediente complementario 2, Archivo complementario 3, Expediente complementario 4, Expediente complementario 5, Archivo complementario 6, Expediente complementario 7, Expediente complementario 8, Expediente complementario 9, Expediente complementario 10, Archivo complementario 11, Archivo complementario 12, Expediente complementario 13 y Archivo complementario 14), configurar y comenzar a imprimir. Retire la pieza de la cama de impresión. Enjuague el pegamento a base de acetato de polivinilo de la base del componente impreso con agua y retire cualquier estructura de soporte. Rocíe el componente DPI con dos capas de pintura en aerosol brillante transparente. 3. Fabricación del molde del anillo plastisol Ensamble una forma de molde lo suficientemente grande como para sostener las piezas del patrón construyendo un recinto rectangular utilizando bloques de plástico a presión sobre una base (Figura suplementaria S1A). Mezcle el monómero de silicona RTV y el catalizador en una proporción de 10: 1, y revuelva sin introducir burbujas durante 1 minuto. Coloree agregando colorante alimentario (3 gotas/25 ml de mezcla de silicona) y jabón de manos (1 ml de jabón/25 ml de mezcla de silicona) (Figura suplementaria S1B). Vierta una capa delgada de silicona en la forma del molde que sea suficiente para cubrir completamente el fondo. Tamp para aplanar la superficie y esperar 24 h para que la silicona se fije (Figura suplementaria S1C). Vierta una segunda capa de silicona, como se describió anteriormente, que sea lo suficientemente profunda como para cubrir la impresión del núcleo del orificio central en el patrón (visible en la parte superior del patrón en la Figura Suplementaria S1D). Inserte el patrón en la silicona líquida con la impresión del núcleo del orificio central hacia abajo. Asegúrese de que no queden burbujas atrapadas y que los patrones estén bien separados y no se toquen (Figura suplementaria S1E). Asegure los patrones con un objeto pesado y / o cinta adhesiva para evitar que floten fuera de la silicona mientras se asienta. Espere 24 h para que la capa recién vertida se fije (Figura suplementaria S1F). Vierta capas adicionales de silicona hasta que el nivel esté al ras con la parte superior del patrón. Esperar 24 h para curar (Figura Suplementaria S1G). Desmonte los bloques de plástico a presión para liberar el molde. Elimine los patrones (Figura suplementaria S1H). Inspeccione el molde en busca de desgarros o deformidades (Figura suplementaria S1I). 4. Fundición de los anillos de plastisol Cubra el interior del molde, todos los componentes principales y las juntas tóricas con aceite de cocina (Figura suplementaria S2A, B). Coloque una junta tórica alrededor de la muesca en el centro del núcleo del poste central y coloque el núcleo en el orificio central del molde del anillo de plastisol (Figura suplementaria S2C). Inserte el núcleo del canal de entrega en el orificio en el lado del molde del anillo de plastisol. Oriente la punta en forma de V al final del núcleo del canal de entrega para alinearla con la junta tórica en el núcleo del poste central (Figura suplementaria S2D,E). Calentar el plastisol en el microondas durante ráfagas cortas de 10 s (Figura suplementaria S2F, G). Revuelva el plastisol suavemente para evitar burbujas (Figura suplementaria S2H). Repetir el calentamiento y la agitación hasta que la solución alcance una temperatura entre 160 °C y 170 °C (Figura complementaria S2I).PRECAUCIÓN: El sobrecalentamiento del plastisol puede conducir a la liberación de humos tóxicos. Realice el procedimiento en un área bien ventilada o campana extractora. No caliente el plastisol a más de 170 °C. Vierta el plastisol fundido en el molde del anillo de plastisol cerca del borde exterior del molde sin introducir burbujas (Figura suplementaria S2J). Espere 1 h para que los anillos de plastisol se enfríen (Figura suplementaria S2K). Retire los anillos del molde. Asegúrese de que el dispositivo DPI se ajuste correctamente antes de usarlo en ensayos experimentales (Figura suplementaria S2L). 5. Fijación del dispositivo DPI a la planta Encuentre un sitio suave y saludable en el tronco para el accesorio del dispositivo. Evite cualquier golpe o nudo, ya que pueden contribuir a la fuga del dispositivo. Utilice una broca de 2 mm de diámetro para perforar un orificio horizontalmente a través del centro del vástago en un ángulo de 90° con la superficie del tronco (Figura suplementaria S3A). Pase la broca por el orificio varias veces para limpiarlo y alisarlo para crear un orificio sin obstrucciones (Figura suplementaria S3B). Cree una rebanada vertical en el anillo de plastisol en el lado opuesto del canal de suministro del compuesto (Figura suplementaria S3C). Coloque el anillo alrededor de la planta y alinee el canal de suministro con el orificio previamente perforado (Figura suplementaria S3D).NOTA: El anillo debe ajustarse perfectamente alrededor del maletero para evitar fugas; Los conjuntos de núcleos con varios diámetros se pueden usar para hacer anillos de plastisol para tallos de plantas de diferentes tamaños. Agregue el dispositivo DPI al anillo de plastisol, asegurándose de que encajen perfectamente. Alinee el pico del dispositivo DPI con el canal de suministro del anillo de plastisol y el orificio perforado (Figura suplementaria S3E).NOTA: El uso de una broca para alinear el orificio y el pico del dispositivo DPI puede ser útil. Envuélvase firmemente con cinta de silicona para mantener el aparato en su lugar (Figura suplementaria S3F). Inspeccione el dispositivo completamente ensamblado y conectado para garantizar la alineación y orientación adecuadas en la planta. 6. Aplicación del compuesto de interés utilizando el dispositivo DPI Utilice una jeringa o pipeta para llenar el dispositivo DPI con la solución de interés (Figura complementaria S3G). Utilice una jeringa para penetrar la cinta de silicona y el anillo de plastisol en el lado opuesto del dispositivo DPI para extraer el aire del canal interior y evitar la introducción de burbujas de aire en la vasculatura de la planta (Figura suplementaria S3H). Reemplace cualquier compuesto extraído de nuevo en el dispositivo DPI. Agregue un pequeño parche adicional de cinta de silicona sobre el orificio creado por la jeringa para reforzar el área y evitar desgarros. Inspeccione el aparato en busca de fugas visibles en el punto de fijación e inspeccione el depósito del dispositivo para un nivel de líquido estable.NOTA: El agua se puede usar inicialmente para detectar fugas y evitar el desperdicio de la solución de prueba. Cubra el extremo abierto del dispositivo DPI con una película de sellado de cera y tire hacia abajo para formar un sello y reducir la evaporación del compuesto experimental. Pinche un solo orificio en la película de cera con la punta de una jeringa para evitar el desarrollo de un vacío y, posteriormente, rellene el dispositivo (Figura suplementaria S3I). Revise el aparato diariamente para asegurar la alineación correcta de los componentes (Figura Suplementaria S3J), y llene el líquido con una jeringa para evitar que el depósito se seque. Repita este proceso hasta que se haya introducido la cantidad deseada de solución experimental.NOTA: Los compuestos se pueden introducir con éxito desde un dispositivo determinado durante un máximo de 1 mes. Las duraciones de absorción de la solución que excedan este marco de tiempo deben probarse empíricamente antes de la configuración experimental. 7. Uso de CFDA para observar el movimiento vascular con plantas de cítricos Conecte el dispositivo DPI a plantas de cidra (Citrus medica L.) de 25 cm de altura, aplique un solo tratamiento de 2.0 ml de DMSO al 20% en control deH2Oo CFDA al dispositivo DPI, y deje que absorba durante 24 h. Para seguir este protocolo, prepare la solución de CFDA de trabajo agregando 1,6 ml deH2Oa 400 μL de solución madre de CFDA (la solución madre contiene 10 mM de CFDA disuelto en 100% de dimetilsulfóxido [DMSO]) para generar una concentración final de CFDA de 2 mM y 20% de DMSO. Haga secciones transversales de varios tejidos de la planta y use un microscopio estereoscópico o compuesto con un filtro fluorescente que incluya la longitud de onda de 498 nm para visualizar el CFDA en los tejidos vegetales. Compare las imágenes con el DMSO al 20% en los controles deH2Opara tener en cuenta la autofluorescencia en el tejido. 8. Medición de los cambios en el título de CLas en muestras de hojas después del tratamiento con estreptomicina Utilizando plantas de Valencia (Citrus sinensis (L .) Osbeck “Valencia”) infectadas con CLas de 0,75 m de altura, recolecte el pecíolo y la nervadura central de dos hojas sintomáticas de HLB de cada planta, córtelas en pequeñas secciones, agrupe cada tipo de tejido y guárdelas por separado en tubos de muestra resistentes a los impactos de 2 ml que contienen una bola de acero de 6,35 mm de diámetro. Moler la muestra utilizando un homogeneizador programado para dos ciclos de 15 s a 3,4 m/s. Extraer el ácido nucleico total como se describió anteriormente19. Realizar qPCR en las muestras de hojas infectadas con CLas utilizando la mezcla de qPCR definida en la Tabla 1 y las condiciones de reacción definidas en la Tabla 2. Utilice plantas que muestren infecciones por CLas robustas (la infección robusta generalmente se define como valores de Ct basados en qPCR < 30 para el conjunto de cebadores CLas 16S LasLong (LL)) para un análisis adicional.NOTA: El título bacteriano se estima utilizando CLas 16S Las Long (LL) y cebadores de ADN de dehidrina cítrica para estimar los equivalentes relativos del genoma, como se describió anteriormente20. Equipe las plantas de cítricos que cumplan con el título mínimo de infección descrito anteriormente con dispositivos DPI y sométalas a un tratamiento único de 2.0 ml de solución deH2Oo solución de estreptomicina a la concentración deseada. Para seguir este estudio, use un solo tratamiento de 2.0 ml de 9.5 mg / ml (19 mg en total) de estreptomicina disuelta enH2O. Recoja muestras de hojas a los 7 días, 14 días y 28 días después del tratamiento. Analizar las hojas muestreadas para el título de CLas utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente. A los 60 días después del tratamiento, obtener fotografías de las plantas tratadas conH2Oo estreptomicina. Utilice observaciones visuales de la infección por CLas para calificar la gravedad de la infección. Busque el <50% de las hojas que muestran clorosis intervenal y taponamiento de las venas junto con el crecimiento del rubor de las hojas como signos de infección leve y más del 50% de las hojas con clorosis intervenal y taponamiento de venas, así como abscisión de las hojas y retraso en el crecimiento de la planta como signos de infecciones más graves. 9. Medición de la mortalidad de D. citri tras el tratamiento con imidacloprid Pode las plantas de cidra (Citrus medica L.) de 0,5 m de altura a una altura de 12 cm para fomentar el crecimiento de nuevas descargas.NOTA: La velocidad de crecimiento del enjuague puede depender de la salud de la planta y la época del año; Por lo tanto, tenga esto en cuenta durante el diseño experimental. Después de que se hayan desarrollado >6 enjuagues, de 1-2 cm de longitud, introduzca las plantas en jaulas que contengan D. citrri adulto. Deje las plantas en las jaulas durante 24 h para permitir la deposición de huevos. Realice recuentos representativos de huevos en tres brotes de lavado 1-2 días después de la puesta, y posteriormente aplique los dispositivos DPI. Llene estos dispositivos con 2.0 ml de un control de agua o la concentración deseada de imidacloprid (21.8% de ingrediente activo). Para seguir este protocolo, use 528 μL/L, 52.8 μL/L y 5.28 μL/L de imidacloprid.NOTA: Los recuentos de huevos son una medida destructiva, por lo que los recuentos en esta etapa se utilizan para estimar el número de huevos en el flujo no contado de la misma planta y ayudar a proporcionar una línea de base para los recuentos posteriores de emergencia de ninfas que se realizan al final del experimento. Recopile la tasa de emergencia de D. citri en al menos tres de los brotes restantes. Adquiera fotografías representativas de la planta 7 días después de la introducción del compuesto.

Representative Results

Componentes del dispositivo de infusión directaLa versión base del dispositivo de infusión directa mide 8 cm de alto y 3,3 cm de ancho en la parte frontal y lateral (Figura 1A). Contiene un solo depósito central que es contiguo con el pico, y el volumen total que puede estar contenido dentro de estos componentes es de 2.0 ml (Figura 1D). El anillo de plastisol mide 1,8 cm de altura y tiene un diámetro de 2,7 cm (Figura 1C). Este anillo también contiene dos canales: uno para acomodar el pico del dispositivo DPI y otro de diámetro variable que se ajusta alrededor del tronco del árbol que se está tratando. Además, hay una ranura alrededor del canal vertical para dirigir el exceso de tratamiento para rodear el árbol, lo que permite la absorción adicional de compuestos a través de la corteza (Figura 1F). Cuando se ensambla correctamente, el anillo de plastisol debe estar al ras contra el dispositivo DPI, y el pico debe alinearse con el orificio perforado en el árbol (Figura 1B y Figura 1E). CFDAPara investigar la efectividad del dispositivo DPI para introducir productos químicos exógenos en plantas de cítricos, se infiltraron 2,0 ml de CFDA de 2 mM utilizando el dispositivo. Se detectó una señal de fluorescencia en la vasculatura de la planta tratada (Figura 2A) pero estuvo ausente en las plantas control tratadas con DMSO al 20% enH2O(Figura 2B). Esta señal se observó en todos los tipos de tejido vegetal disecados, incluyendo el mesófilo de la hoja, la vasculatura del pecíolo, la vasculatura del tallo y la vasculatura de la raíz (Figura 2C). Esta señal se observó en la planta dentro de las 24 h de tratamiento y se distribuyó de manera relativamente uniforme en todos los tejidos. EstreptomicinaPara probar si los compuestos introducidos tenían un efecto terapéutico sobre la enfermedad HLB, se introdujeron 2,0 ml de un compuesto bactericida, estreptomicina, en plantas de naranjo dulce de Valencia (Citrus sinensis) positivas para CLas a una concentración de 9,5 mg / ml (19 mg en total). Estas plantas se mantuvieron en macetas de invernadero, y el título de CLas (medido por equivalentes de genoma de CLas por equivalentes de genoma de cítricos) se monitoreó a lo largo del tiempo utilizando qPCR (Figura 3A). Los títulos iniciales promedio de CLas de ADN para las plantas tratadas con estreptomicina y H2O fueron 0.562 CLas genoma / genoma cítrico y 0.49 CLas genoma / genoma cítrico, respectivamente. Las reducciones en el título bacteriano medio se detectaron mediante qPCR 7-28 días después del tratamiento con estreptomicina en comparación con los controles deH2Oen el mismo punto de tiempo. Además, la diferencia entre los títulos bacterianos medios del tiempo 0 y el día 28 fue de 0,314 y 0,117 para las plantas tratadas con estreptomicina y las plantas tratadas con H2O, respectivamente. Este experimento fue diseñado para medir la respuesta de la planta a diferentes tratamientos durante diferentes períodos de tiempo. Se utilizó un diseño superficial de respuesta cuadrática de dos factores, con el tiempo tratado como un factor discreto cuantitativo con cuatro niveles (0 días, 7 días, 14 días y 28 días) y el tratamiento como factor categórico con dos niveles (H2Oy estreptomicina). Se utilizaron cinco réplicas para cada una de las ocho combinaciones de tratamiento, y el título de CLas se midió como la variable de respuesta. Los datos se transformaron utilizando log10 basado en un análisis de diagrama de Box-Cox. La reducción del modelo se realizó mediante la selección hacia adelante utilizando el criterio de información de Akaike (AICc)21, lo que resultó en la eliminación de los efectos de tiempo e interacción. El factor restante, el tratamiento, fue significativo (p = 0,0252), con plantas tratadas con estreptomicina mostrando un título medio de CLas más bajo (0,349) que las plantas tratadas con H2O (0,496) en todos los puntos temporales combinados (Figura 3B). Esta reducción en el título de CLas correspondió a aumentos ocasionales en el nuevo crecimiento saludable después de 60 días en las plantas tratadas con estreptomicina, como lo demuestran las fotografías de árboles representativos tratados conH2O(Figura 3C) versus 19 mg de estreptomicina (Figura 3D). ImidaclopridEl imidacloprid se introdujo en plantas de cidra infestadas de psílidos asiáticos (ACP) utilizando el dispositivo DPI para probar su potencial como ensayo de detección insecticida de D. citri. Se probó un solo tratamiento de 2.0 ml de una solución insecticida comercial de imidacloprid a tres concentraciones diferentes (5.28 μL / L, 52.8 μL / L y 528 μL / L), junto con un control de agua. El recuento total promedio de huevos por tres brotes de lavado antes del tratamiento varió de 280.5 a 321, y no hubo diferencias significativas entre las plantas que se usaron para cada grupo de tratamiento (Figura 4A). El total promedio de ninfas sobrevivientes en tres brotes de lavado 7 días después del tratamiento fue 293.75, 268, 97.5 y 2 para el control del agua y 5.28 μL / L, 52.8 μL / L y 528 μL / L soluciones de imidacloprid, respectivamente (Figura 4B). Esto representó una reducción significativa en la emergencia de ninfas psílidos a los niveles de solución de imidacloprid de 52.8 μL / L (p = 0.029) y 528 μL / L (p = 0.002) en comparación con el control del agua según un ANOVA unidireccional seguido de un análisis post-hoc de Tukey. Además, este aumento en la mortalidad de ninfas de psílidos en el nivel más alto de solución de imidacloprid fue visualmente evidente por la reducción en la producción de mielada ninfa en las líneas tratadas con imidacloprid (Figura 4D) en comparación con el control del agua (Figura 4C). Figura 1: El dispositivo de infusión directa de la planta y el anillo de plastisol. (A) El dispositivo de infusión directa de la planta intacto y (C) el anillo de plastisol junto con sus dimensiones. (B) El dispositivo de infusión directa de la planta y el anillo de plastisol conectados y unidos a un árbol de cítricos. Secciones transversales verticales del (D) dispositivo de infusión directa de la planta, (F) anillo de plastisol, y (E) estos dos componentes conectados y unidos a un árbol de cítricos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Sección transversal de la nervadura central de una planta de cítricos de 25 cm. Imágenes que muestran 24 h después del tratamiento con (A) 2 mM CFDA o (B) 20% DMSO enH2Outilizando el dispositivo de infusión directa de la planta. (C) Secciones transversales de diversos tejidos vegetales 24 h después de un tratamiento CFDA de 2 mM, incluido el tronco 5 cm por encima del dispositivo de infusión directa de la planta (arriba a la izquierda), el tronco 5 cm por debajo del dispositivo de infusión directa de la planta (centro izquierda), la raíz (abajo a la izquierda), la nervadura central de la hoja (arriba a la derecha), el pecíolo de la hoja (centro derecho) y el mesófilo de la hoja (abajo a la derecha). Barras de escala = 1 mm. Abreviaturas: CFDA = 5,6-carboxifluoresceína-diacetato; DMSO = dimetilsulfóxido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Seguimiento del título de CLas (medido por equivalentes de genoma de CLas por equivalentes de genoma de cítricos) a lo largo del tiempo mediante qPCR. (A) Evolución temporal que muestra cambios en el título de ADN de CLas comparando las cinco plantas tratadas con 19 mg de estreptomicina con las cinco plantas tratadas con un control deH2O. Los puntos representan el promedio de un tratamiento dado en un momento dado. Las barras de error representan el error estándar de la media. (B) Gráfico de barras que muestra el título medio de CLas de las plantas tratadas con H2O y estreptomicina en todos los puntos temporales. Las barras de error representan el intervalo de confianza del 95%, y los asteriscos denotan diferencias significativas (* = p < 0,05) entre los títulos medios de CLas para las plantas tratadas con estreptomicina y H2O según un ANOVA unidireccional. (C) Imágenes representativas de plantas de cítricos 0 meses y 2 meses después del tratamiento directo de infusión de plantas con (C)H2Oo (D) estreptomicina. Las plantas tratadas con estreptomicina muestran un nuevo crecimiento de hojas de color verde claro después de 2 meses, lo que sugiere una reducción en el título de CLas. Abreviatura: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Monitoreo de la mortalidad de ninfas psílidos en plantas juveniles de cidra infestadas de ACP. Gráficos de barras que muestran (A) los recuentos iniciales estimados de huevos y (B) las ninfas sobrevivientes de D. citri en tres enjuagues de cítricos 7 días después del tratamiento con un control de agua y varias diluciones de imidacloprid. Las barras de error representan el error estándar de la media, y los asteriscos denotan diferencias significativas (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) entre un nivel de tratamiento dado y el control del agua de acuerdo con un ANOVA unidireccional seguido de un análisis post-hoc de Tukey. Imágenes de D. citri infestado de ninfas cítricas 7 días después del tratamiento con (C) el control de agua o (D) 528 μL/L imidacloprid utilizando el dispositivo de infusión directa de la planta. Abreviaturas: ACP = psílido asiático de los cítricos; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Volumen por muestra (μL) Componente 12.5 2x GoTaq qPCR con BRYT Green Dye Master Mix 5 Plantilla de ADN (20 ng/μL) 0.5 Cebador F y R de 10 μM para CLas Clas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (Delantero);TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (Reverso) 0.5 Imprimación F y R de 10 μM para el mantenimiento de cítricos Deshidratina de cítricos: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (Forward);AAAACTTCACCGATCCACCAG (Reverso) 6.5 H2O Tabla 1: La mezcla de qPCR utilizada para cuantificar el título de CLas en líneas de cítricos tratadas con estreptomicina. Se muestra la secuencia de los cebadores 16S Las Long y los cebadores de deshidrina cítrica para la cuantificación de ADN CLas y la cuantificación de ADN cítrico. Paso Temperatura (°C) Hora 1 Desnaturalización inicial 95 2 minutos 2 Desnaturalizar 95 15 s 3 Recocido 60 20 s 4 Extensión 72 20 s 5 Vaya al paso 2, repita 39x 6 Curva de fusión 60 rampas a 95 a 0,2 °C/s 3 minutos Tabla 2: Condiciones de reacción para la qPCR utilizada para cuantificar el título de CLas en líneas de cítricos tratadas con estreptomicina. Figura Suplementaria S1: Imágenes que muestran el proceso de montaje del molde para generar el anillo de plastisol. (A) Se utilizaron bloques de plástico a presión para generar la primera capa del molde del anillo de plastisol. (B) Solución mezclada uniformemente que contiene caucho RTV de silicona, catalizador, colorante alimentario y jabón. (C) Primera capa vertida uniformemente del molde del anillo de plastisol. (D) Imagen de los patrones de anillos de plastisol con la impresión central en la parte superior. (E) Patrones de anillos de plastisol insertados en la segunda capa sin curar del molde. (F) Cinta adhesiva de enmascarar y mazo de goma utilizados para asegurar los patrones a medida que se cura la segunda capa. (G) Tercera capa del molde añadida hasta que quede al ras con la parte superior de los patrones. (H) Eliminar los patrones del molde. (I) Molde de anillo de plastisol completamente construido. Haga clic aquí para descargar este archivo. Figura complementaria S2: Imágenes que muestran el proceso de ensamblaje del anillo de plastisol asociado con el dispositivo de infusión directa de la planta. (A) Componentes del conjunto del anillo Plastisol, incluido el molde, el núcleo central con una junta tórica y el núcleo del canal de suministro. (B) Recubrimiento de los núcleos con aceite de cocina en aerosol antiadherente para facilitar la eliminación del anillo de plastisol después del endurecimiento. (C) Inserción del núcleo central y la junta tórica en el molde. (D) Inserción del núcleo del canal de entrega perpendicular al núcleo central. (E) Montaje adecuado de los componentes centrales del anillo de plastisol en la cavidad del molde. (F) Plastisol utilizado para la generación del anillo de plastisol. (G) Calentar el plastisol en el microondas. (H) Agitación del plastisol después del calentamiento. (I) Comprobación de la temperatura del plastisol. (J) Verter el plastisol calentado en el núcleo ensamblado. (K) Permitir el enfriamiento del plastisol alrededor del núcleo ensamblado. (L) Anillos de plastisol completamente ensamblados unidos al dispositivo de infusión directa de la planta. Haga clic aquí para descargar este archivo. Figura complementaria S3: Imágenes que muestran el proceso de montaje del dispositivo de infusión directa de la planta. (A) Perforar un agujero a través del centro de la planta de cítricos para crear un canal para la entrega de compuestos. (B) Vista frontal del orificio perforado. (C) Cortar a través del anillo de plastisol con una cuchilla de afeitar opuesta al canal de suministro compuesto. (D) Colocar el anillo de plastisol firmemente alrededor del vástago en el sitio del orificio previamente perforado. (E) Ajuste del dispositivo de infusión directa de la planta al anillo de plastisol, con el grifo de suministro compuesto en el dispositivo insertado en el canal del anillo de plastisol. (F) Usar cinta de silicona para asegurar el dispositivo de infusión directa de la planta al anillo de plastisol y mantener todo el aparato en su lugar. (G) Llenar la cámara del dispositivo de infusión directa de la planta con el compuesto de interés. (H) Usar una jeringa para extraer aire del orificio perforado en la planta y comenzar el flujo del compuesto. (I) Aplicar una película de sellado de cera a la abertura en la cámara del dispositivo de infusión directa de la planta y hacer un agujero para evitar el vacío. (J) Dispositivo de infusión directa de plantas completamente ensamblado en una planta de cítricos. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 1: El núcleo del poste central del anillo de plastisol. Archivo STL para un árbol de 4 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 2: El núcleo del poste central del anillo de plastisol. STL para un árbol de 6 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 3: El núcleo del poste central del anillo de plastisol. STL para un árbol de 8 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 4: El núcleo del poste central del anillo de plastisol. Archivo STL para un árbol de 10 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 5: El núcleo del poste central del anillo plastisol. Archivo STL para un árbol de 12 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 6: El núcleo del poste central del anillo de plastisol. STL para un árbol de 14 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 7: El núcleo del canal de entrega del anillo de plastisol. Archivo STL para un árbol de 4 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 8: El núcleo del canal de entrega del anillo plastisol. STL para un árbol de 6 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 9: El núcleo del canal de entrega del anillo plastisol. STL para un árbol de 8 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 10: El núcleo del canal de entrega del anillo plastisol. Archivo STL para un árbol de 10 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 11: El núcleo del canal de entrega del anillo de plastisol. Archivo STL para un árbol de 12 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 12: El núcleo del canal de entrega del anillo de plastisol. STL para un árbol de 14 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo. Expediente complementario 13: El dispositivo de infusión directa de la planta. STL. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 14: El patrón utilizado para crear el molde para el anillo de plastisol. STL. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Para que el dispositivo DPI se considere un método viable para la administración de compuestos exógenos en las plantas, debe contribuir a una absorción de compuestos robusta y consistente en una variedad de tipos de tejidos. El experimento que utilizó CFDA mostró claramente el movimiento de compuestos acropetales y basípetos, así como tanto en el sistema vascular como en las células mesófilas de la hoja. Además, y presumiblemente porque el orificio perforado utilizado en este dispositivo DPI proporciona una gran cantidad de área de superficie para la absorción del compuesto, el CFDA estuvo presente en cantidades relativamente iguales en todas las secciones del tallo, no solo en un pequeño subconjunto de la vasculatura adyacente al dispositivo, como se ha visto en estudios previos de captación de tinte en plantas que usan inyección de tronco6. Además, se probó la entrega de proteína verde fluorescente y colorante floral utilizando el dispositivo DPI, y se observó una distribución de estos compuestos similar al CFDA (datos no mostrados). Estos datos sugieren que el dispositivo se puede utilizar para administrar sistemáticamente una variedad de compuestos que varían en tamaño y estructura molecular. Sin embargo, vale la pena señalar que hubo diferencias en la absorción del compuesto en función de la etapa de desarrollo de la hoja, con hojas en desarrollo más jóvenes que absorben más compuestos que las hojas establecidas más viejas. Esto puede deberse a los cambios en las propiedades de la vasculatura presentes en el sumidero frente al tejido fuente y debe optimizarse para un experimento dado.

El dispositivo DPI mostró suficiente absorción de compuestos para la visualización de CFDA, GFP y colorante floral, y también tomó lo suficiente para mostrar los efectos antibacterianos e insecticidas de la estreptomicina y el imidacloprid, respectivamente. Ambos compuestos dieron lugar a cambios en la viabilidad del organismo diana 1 semana después de un solo tratamiento de 2,0 ml. Estos datos sugieren que el dispositivo DPI podría usarse en ensayos de plantas completas para probar la viabilidad de una amplia variedad de compuestos para el control de plagas microbianas e insectos. Además, debido a su contacto directo con el sistema vascular, este dispositivo puede incluso proporcionar la oportunidad de probar compuestos que no son absorbidos eficientemente por las raíces o las células epidérmicas. De particular interés sería la interferencia de ARN (ARNi), ya que podría usarse para modular la expresión génica dentro de la planta huésped, patógeno o vector patógeno. Investigaciones anteriores que introdujeron ARN horquilla a través de un agujero perforado en el tronco de las plantas de manzana y uva mostraron que las moléculas de ARN estaban restringidas al tejido del xilema, lo que sugiere que estas moléculas solo pueden ser efectivas contra los organismos que mastican y alimentan la savia del xilema22. Dado que el dispositivo DPI utiliza un sistema de administración de orificios perforados similar, es lógico pensar que el ARN de horquilla administrado con este dispositivo también puede estar restringido al tejido del xilema. Sin embargo, la disminución observada en el título de CLas limitados por floema después del tratamiento con estreptomicina del dispositivo DPI sugiere fuertemente que este antibiótico estaba presente en el floema. Por lo tanto, es probable que la distribución vascular de los compuestos administrados utilizando el dispositivo DPI dependa de su tamaño y química, y cada molécula debe evaluarse de forma individual.

Aunque hay una serie de dispositivos DPI disponibles comercialmente disponibles en el mercado, el dispositivo descrito aquí se puede fabricar internamente y es modificable. De esta manera, se pueden realizar mejoras y cambios de tamaño en función de la especie vegetal y el diseño experimental que se utiliza, y no depende de productos comerciales. Además, el dispositivo está conectado semipermanentemente a la planta, lo que significa que se pueden realizar múltiples tratamientos de un compuesto dado simultáneamente sin tener que volver a lesionar la planta con múltiples inyecciones de compuestos. En una nota de precaución, el dispositivo puede tener fugas si no se instala correctamente. Como resultado, el compuesto se pierde en el medio ambiente en lugar de ser entregado a la planta. Por lo tanto, se debe tener cuidado de inspeccionar el dispositivo para detectar cualquier signo de fuga durante la configuración y los primeros días después. Aunque perforar un agujero en el árbol es potencialmente dañino, este método fue elegido para garantizar una absorción de compuestos robusta y consistente. Además, no se observaron efectos adversos sobre la salud de las plantas a partir de la fijación del dispositivo DPI en estos experimentos. Sin embargo, se deben incluir plantas adicionales en el diseño experimental para reemplazar aquellas que pueden perder vigor a lo largo del curso de un experimento dado. Por último, dado que este dispositivo utiliza el flujo pasivo para introducir compuestos, puede ser difícil predecir la tasa de absorción en diferentes especies de plantas o etapas de desarrollo de la misma especie. Esto puede complicar los experimentos si la velocidad de absorción del compuesto es un factor limitante. Para obtener los mejores resultados, los experimentos deben planificarse de manera que se proporcione suficiente tiempo para que la planta absorba completamente los 2,5 ml de compuesto, lo que puede llevar hasta 1 semana. En conclusión, este dispositivo DPI es una herramienta eficaz para la evaluación rápida de la actividad en planta de compuestos antimicrobianos o insecticidas contra CLas y su vector, D. citri, proporcionando así más información sobre la efectividad sistémica y la influencia en el rendimiento de la planta que el ensayo de hoja desprendida presentado anteriormente23. Sin duda, la variedad de aplicaciones para este sistema va mucho más allá de los usos específicos descritos en este estudio.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Mant Acon por las plantas utilizadas en este estudio. El financiamiento fue proporcionado por el proyecto CRIS 8062-22410-007-000-D del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y la subvención NIFA del USDA 2020-70029-33176.

Materials

0.5 cm Diameter Steel Balls Ballistic Products Inc. #SHT #T
10 mL Luer-Lok Syringe Becton Dickinson 382903029952
20 G 1 Syringe Needle Becton Dickinson 305175
2 mL Screw Cap Tubes USA Scientific 1420-9710
3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit Sears 964077
3D Printer Markforged F-PR-2027
3D Printing Software Markforged F-SW-FDVX
3D Printing Software Markforged S-FW-OEVX
5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) Invitrogen C195
5/64th Inch Black Oxide Drill Bit Sears 964502
96 Well qPCR Machine Roche 5815916001
Centrifuge Eppendorf 22621408
Fluorescent Microscope Olympus SP-BX43-BI
Fluorescent Microscope Filter Chroma 69401-ET
Gloss Clear Spray Paint Rustoleum 249117
Grey Lego Baseplate Lego 11024
Handheld Cordless Drill Makita 6349D
Homogenizer Fisher Scientific 15-340-163
Imidacloprid 2F Quali-Pro 83080133
Liquid Plastisol Medium Hardness Fusion X Fishing Lures XSOL-505
Red Silicone 70 Shore A O-Ring Grainger Varies by Size
Non-Stick Cooking Spray PAM 64144030217
NucleoSpin Plant II Macherey-Nagel 740770.5
Parafilm Bemis HS234526A
Poly Viyl Acetate Based Glue Elmers E301
qPCR Master Mix Promega A6001
qPCR Primers Integrated DNA Technologies Varies by DNA sequence
Reverse Transcriptase Promega A5003
Single Edge Razor Blade Garvey 40475
Translucent Silicone RTV Rubber Aero Marine Products AM 115T
Transparent Silicone Tape Maxwell KE30S
Truncated Oncocin 112 Genscript Varies by peptide sequence
White 1 x 6 Lego Piece Lego 300901
White Nylon Markforged F-MF-0003
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Referências

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Rhodes, B. H., Stange, R. R., Zagorski, P., Hentz, M. G., Niedz, R. P., Shatters, R. G., Pitino, M. Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants. J. Vis. Exp. (196), e65194, doi:10.3791/65194 (2023).
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