La sindrome di Angelman (AS) è una rara malattia del neurosviluppo. L’origine genetica più comune della SA è una grande delezione della regione 15q11-q13 del cromosoma di origine materna, che si trova in quasi il 74% dei pazienti¹. La delezione di questa regione provoca la perdita di UBE3A, il principale gene causativo della SA che codifica per l’ubiquitina ligasi E3. L’allele paterno del gene UBE3A nei neuroni viene silenziato in un processo noto come imprinting. Di conseguenza, l’imprinting paterno del gene consente solo l’espressione materna nel sistema nervoso centrale (SNC)². Pertanto, la delezione del gene UBE3A dal cromosoma di origine materna porta allo sviluppo dei sintomi della SA. Nell’uomo, la SA si manifesta intorno ai 6 mesi di età, con ritardo dello sviluppo che persiste in tutte le fasi dello sviluppo e provoca gravi sintomi debilitanti nei soggetti affetti ^3,4. I sintomi principali del disturbo includono il deficit delle capacità motorie fini e grossolane, tra cui andatura atassica a scatti, grave compromissione del linguaggio e disabilità intellettiva. Circa l’80% dei pazienti con SA soffre anche di disturbi del sonno ed epilessia. Ad oggi, l’unico trattamento disponibile sono i farmaci sintomatici, che riducono le crisi epilettiche e migliorano la qualità del sonno¹. Pertanto, lo sviluppo di modelli animali robusti con fenotipi comportamentali riproducibili insieme a una raffinata analisi della fenotipizzazione sarà essenziale per chiarire i meccanismi fisiopatologici del disturbo e scoprire farmaci e trattamenti efficaci.

La complessità del disturbo umano che colpisce il sistema nervoso centrale richiede che gli organismi modello possiedano un genoma, una fisiologia e un comportamento comparabili. I topi sono popolari come organismi modello a causa del loro breve ciclo riproduttivo, delle piccole dimensioni e della relativa facilità di modifica del DNA. Nel 1984, Paul Willner ha proposto tre criteri di base per la validazione del modello di malattia: il costrutto, il volto e la validità predittiva, che vengono utilizzati per determinare il valore del modello⁵. Semplicemente, la validità del costrutto riflette i meccanismi biologici responsabili dello sviluppo del disturbo, la validità del volto ne ricapitola i sintomi e la validità predittiva descrive la risposta del modello ai farmaci terapeutici.

Per aderire ai principi di cui sopra, abbiamo scelto l’eziologia genetica più comune, una grande delezione del locus materno 15q11.2-13q che include il gene UBE3A, per creare topi modello AS. Abbiamo usato la tecnica CRISPR/Cas9 per eliminare una regione lunga 76.225 bp che copre l’intero gene UBE3A, comprendendo sia gli elementi codificanti che quelli non codificanti del gene, nei topi provenienti da un background C57BL/6N⁶. Abbiamo quindi allevato gli animali per ottenere topi eterozigoti UBE3A^+/−. Per la validazione facciale del modello, abbiamo utilizzato animali provenienti da incroci di femmine UBE3A+/⁻ e maschi wild-type per ottenere la progenie UBE3A+/- (ceppo denominato C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph e successivamente assegnato come UBE3A ^mGenedel/+) e compagni di cucciolata di controllo. Abbiamo testato le loro capacità motorie fini e grossolane, l’emotività e l’affetto per ricapitolare i sintomi principali dell’AS. In un precedente articolo, abbiamo anche valutato le funzioni cognitive degli animali, poiché i pazienti con AS soffrono anche di disabilità intellettiva⁶. Tuttavia, non abbiamo riscontrato disturbi cognitivi nei topi^{UBE3A mGenedel/+}, forse a causa della giovane età degli animali al momento del test⁷. L’esame successivo degli animali più anziani, di circa 18 settimane, ha rivelato un deficit nella flessibilità comportamentale durante l’apprendimento inverso nel paradigma della preferenza di luogo. Tuttavia, la complessità delle apparecchiature impiegate per questa analisi richiede un modulo metodologico separato e non è incluso in questa sede.

I test comportamentali qui presentati appartengono agli strumenti di fenotipizzazione più comuni nella ricerca genetica, grazie al loro elevato valore predittivo e alla sufficiente validità del costrutto ^8,9,10. Abbiamo utilizzato questi test per convalidare un modello murino di SA ricapitolando i sintomi principali della malattia umana in modo riproducibile e indipendente dall’età. L’emotività dell’animale è stata valutata nei test di labirinto elevato e campo aperto. Entrambi questi test si basano sul conflitto approccio-evitamento, in cui gli animali esplorano un nuovo ambiente in cerca di cibo, riparo o opportunità di accoppiamento, evitando contemporaneamente i compartimenti ansiogeni¹¹. Inoltre, il test in campo aperto viene utilizzato per testare l’attività locomotoria di un topo⁸. Il test della sospensione della coda è ampiamente utilizzato nella ricerca sulla depressione per lo screening di nuovi farmaci antidepressivi o fenotipi simili alla depressione in modelli murini knockout¹². Questo test valuta la disperazione che gli animali sviluppano nel tempo in una situazione ineluttabile. L’apprendimento motorio e le caratteristiche dettagliate dell’andatura sono state determinate rispettivamente sul rotarod e nel DigiGait. La resistenza dell’animale sull’asta accelerante caratterizza le sue capacità di equilibrio e coordinazione del movimento, mentre l’analisi dettagliata dei modelli di passo di un topo è una valutazione sensibile delle menomazioni neuromuscolari connesse a molti disturbi neurogenerativi del movimento^13,14,15. Il test di triturazione del nido fa parte della metodologia standard per rilevare il comportamento impulsivo nei roditori e, poiché utilizza il comportamento naturale della costruzione dei roditori, indica il benessere dell’animale^16,17.

La dimensione dei gruppi sperimentali è stata il risultato di un compromesso per soddisfare le esigenze della regola 3R e l’uso efficiente delle prestazioni di allevamento delle colonie. Tuttavia, per ottenere potere statistico, i gruppi avevano non meno di 10 individui, a causa della creazione di un numero sufficiente di coppie nidificanti. Purtroppo, le prestazioni riproduttive non sempre hanno portato a un numero sufficiente di animali.