Kalciumavbildning hos mus Superior Colliculus
Summary
Detta protokoll beskriver proceduren för avbildning av kalciumsvar i den överlägsna colliculus (SC) hos vakna möss, inklusive avbildning av enneuronaktivitet med tvåfotonmikroskopi samtidigt som cortex lämnas intakt i vildtypsmöss, och avbildning av hela SC med vidfältsmikroskopi i partiella cortexmutanta möss.
Abstract
Superior colliculus (SC), en evolutionärt bevarad mitthjärnstruktur hos alla ryggradsdjur, är det mest sofistikerade syncentret före uppkomsten av hjärnbarken. Den tar emot direkta indata från ~30 typer av retinala ganglieceller (RGC), där var och en kodar för en specifik visuell funktion. Det är fortfarande svårt att avgöra om SC helt enkelt ärver näthinnefunktioner eller om ytterligare och potentiellt ny bearbetning sker i SC. För att avslöja den neurala kodningen av visuell information i SC tillhandahåller vi här ett detaljerat protokoll för att optiskt registrera visuella svar med två kompletterande metoder i vakna möss. Den ena metoden använder tvåfotonmikroskopi för att avbilda kalciumaktivitet med encellsupplösning utan att ablera den överliggande cortex, medan den andra använder vidvinkelmikroskopi för att avbilda hela SC hos en muterad mus vars cortex i stort sett är outvecklad. Detta protokoll beskriver dessa två metoder, inklusive djurförberedelser, virusinjektion, implantation av huvudplattan, pluggimplantation, datainsamling och dataanalys. De representativa resultaten visar att tvåfotonkalciumavbildningen avslöjar visuellt framkallade neuronala svar vid encellsupplösning, och den vidfältskalciumavbildningen avslöjar neural aktivitet över hela SC. Genom att kombinera dessa två metoder kan man avslöja den neurala kodningen i SC på olika skalor, och en sådan kombination kan också tillämpas på andra hjärnregioner.
Introduction
Superior colliculus (SC) är ett viktigt syncentrum hos alla ryggradsdjur. Hos däggdjur får den direkta intryck från näthinnan och synbarken1. Medan optisk inspelning har tillämpats i stor utsträckning på cortex 2,3,4,5, hindras dess tillämpning i SC av dålig optisk åtkomst 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. Målet med detta protokoll är att ge detaljer om två kompletterande metoder för optisk registrering av den neurala aktiviteten i SC.
SC är belägen under cortex och tvärgående sinus, vilket begränsar optisk åtkomst till kollikulära neuroner. Ett tillvägagångssätt för att övervinna denna begränsning är att aspirera den överliggande cortex och exponera den främre-laterala SC 7,9,10,13,14,19. Men eftersom SC tar emot kortikala ingångar kan en sådan operation påverka hur SC-neuronerna svarar på visuella stimuli. För att övervinna denna begränsning beskriver vi här ett alternativt protokoll för att avbilda det ytliga lagret av den posterior-mediala SC med en kiselplugg, samtidigt som cortex lämnas intakt 8,11. Specifikt, för att uppnå encellsupplösning, tillämpade vi tvåfotonmikroskopi för att avbilda kalciumsvar i den posteriora-mediala SC hos vildtypsmöss. Dessutom, för att uppnå bred täckning, tillämpade vi vidvinkelmikroskopi för att avbilda hela SC av en muterad mus vars bakre cortex inte har utvecklat20.
De två metoder som beskrivs i detta protokoll kompletterar varandra. Kalciumavbildningen med två fotoner utan att ablera cortex är lämplig för att registrera neural aktivitet med encellsupplösning med intakta kortikala ingångar. Kalciumavbildningen med brett fält är lämplig för att registrera neural aktivitet i hela SC samtidigt som den rumsliga upplösningen offras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i protokollet
Det mest kritiska steget är kraniotomin i steg 5.2 och 5.3. För det första är benet 0,5 mm bakom lambdan tjockt och har blodkärl inuti, vilket kan orsaka blödning under borrningsprocessen. Tillräckligt med gelskum bör förberedas för att stoppa blödningen. För det andra finns det en god risk för angiorrhexis när man tar bort benet strax ovanför den tvärgående sinusen. För felsökning är ett alternativt tillvägagångssätt att tunna ut benet inuti ovalen o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation of China (32271060). Y.-t.L. utformade forskningen, utförde experimentet, analyserade data och skrev manuskriptet. Z.L. och R.W. utförde experimentet.
Materials
| 16x objective | Nikon | ||
| 50-mm lens | Computar | M5018-MP2 | |
| 5-mm coverslip | Warner instruments | CS-5R | |
| bandpass filter | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| butyl cyanoacrylate | Vetbond, World Precision Instruments | ||
| camera for monitoring pupil | FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | |
| camera for widefield imaging | Basler | acA2000-165µm | |
| corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| dichroic | Chroma Technology | T600/200dcrb | |
| galvanometers | Cambridge Technology | ||
| glass bead sterilizer | RWD | RS1502 | |
| microdrill | RWD | 78001 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | QUAD | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu | R3896 | |
| rotory encoder | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| self-curing dental adhesive resin cement | SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan | ||
| thermostatic heating pad | RWD | 69020 | |
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| translucent silicone adhesive | Kwik-Sil, World Precision Instruments | ||
| treadmill | Xinglin Biology | ||
| Virus Strains | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Animals | |||
| C57BL/6J wild type | Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Emx1-Cre | The Jackson Laboratory | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh Lab | ||
| Software | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | National Instruments | ||
| MATLAB | Mathworks |
Referências
- May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
- Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
- de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
- Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
- Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
- Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
- de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
- Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
- Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
- Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
- Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
- Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
- Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
- Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
- Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
- Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
- Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
- Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
- Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).
