Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos
Summary
Este protocolo detalha o procedimento para obter imagens de respostas de cálcio no colículo superior (CS) de camundongos acordados, incluindo a obtenção de imagens da atividade de um único neurônio com microscopia de dois fótons, deixando o córtex intacto em camundongos selvagens, e a obtenção de imagens de todo o SC com microscopia de campo largo em camundongos mutantes do córtex parcial.
Abstract
O colículo superior (CS), uma estrutura mesencefálica conservada evolutivamente em todos os vertebrados, é o centro visual mais sofisticado antes do surgimento do córtex cerebral. Ele recebe entradas diretas de ~30 tipos de células ganglionares da retina (RGCs), com cada uma codificando uma característica visual específica. Permanece indefinido se o CT simplesmente herda características retinianas ou se ocorre processamento adicional e potencialmente de novo no CS. Para revelar a codificação neural da informação visual no CS, fornecemos aqui um protocolo detalhado para registrar opticamente as respostas visuais com dois métodos complementares em camundongos acordados. Um método usa microscopia de dois fótons para obter imagens da atividade do cálcio em resolução de célula única sem ablar o córtex sobreposto, enquanto o outro usa microscopia de campo largo para obter imagens de toda a CT de um camundongo mutante cujo córtex é em grande parte subdesenvolvido. Este protocolo detalha esses dois métodos, incluindo preparação animal, injeção viral, implante de placa cefálica, implante de plug, aquisição de dados e análise de dados. Os resultados representativos mostram que a imagem de cálcio de dois fótons revela respostas neuronais visualmente evocadas em resolução de célula única, e a imagem de cálcio de campo largo revela atividade neural em toda a CT. Combinando esses dois métodos, pode-se revelar a codificação neural no CT em diferentes escalas, e tal combinação também pode ser aplicada a outras regiões cerebrais.
Introduction
O colículo superior (CS) é um importante centro visual em todos os vertebrados. Em mamíferos, recebe entradas diretas da retina e do córtex visual1. Embora o registro óptico tenha sido amplamente aplicado no córtex 2,3,4,5, sua aplicação no CT é dificultada por acessos ópticos precários 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. O objetivo deste protocolo é fornecer detalhes sobre dois métodos complementares para o registro óptico da atividade neural no CT.
A CT está localizada abaixo do córtex e do seio transverso, o que limita o acesso óptico aos neurônios coliculares. Uma abordagem para superar essa limitação é aspirar a cortical sobreposta e expor o SC ântero-lateral7,9,10,13,14,19. No entanto, como o CT recebe entradas corticais, tal operação pode afetar a forma como os neurônios do CT respondem aos estímulos visuais. Para superar essa limitação, detalhamos aqui um protocolo alternativo para obter imagens da camada superficial do SC póstero-medial com um tampão de silicone, deixando o córtexintacto8,11. Especificamente, para alcançar a resolução de célula única, aplicamos microscopia de dois fótons para obter imagens de respostas de cálcio na CT póstero-medial de camundongos selvagens. Além disso, para obter ampla cobertura, aplicamos microscopia de campo largo para obter imagens de toda a CT de um camundongo mutante cujo córtex posterior não se desenvolveu20.
Os dois métodos descritos neste protocolo são complementares entre si. A imagem de cálcio de dois fótons sem ablação do córtex é apropriada para registrar a atividade neural em resolução de célula única com entradas corticais intactas. A imagem de cálcio de campo largo é apropriada para registrar a atividade neural em toda a CT enquanto sacrifica a resolução espacial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etapas críticas do protocolo
A etapa mais crítica é a craniotomia nas etapas 5.2 e 5.3. Primeiro, o osso 0,5 mm posterior ao lambda é espesso e tem vasos sanguíneos dentro, o que pode causar sangramento durante o processo de perfuração. Espuma de gel adequada deve ser preparada para parar o sangramento. Em segundo lugar, há uma boa chance de angiorrhexis ao remover o osso logo acima do seio transverso. Para solução de problemas, uma abordagem alternativa é afinar o osso dentro do oval e rem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32271060). Y.-t.L. desenhou a pesquisa, realizou o experimento, analisou os dados e escreveu o manuscrito. Z.L. e R.W. realizaram o experimento.
Materials
| 16x objective | Nikon | ||
| 50-mm lens | Computar | M5018-MP2 | |
| 5-mm coverslip | Warner instruments | CS-5R | |
| bandpass filter | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| butyl cyanoacrylate | Vetbond, World Precision Instruments | ||
| camera for monitoring pupil | FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | |
| camera for widefield imaging | Basler | acA2000-165µm | |
| corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| dichroic | Chroma Technology | T600/200dcrb | |
| galvanometers | Cambridge Technology | ||
| glass bead sterilizer | RWD | RS1502 | |
| microdrill | RWD | 78001 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | QUAD | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu | R3896 | |
| rotory encoder | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| self-curing dental adhesive resin cement | SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan | ||
| thermostatic heating pad | RWD | 69020 | |
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| translucent silicone adhesive | Kwik-Sil, World Precision Instruments | ||
| treadmill | Xinglin Biology | ||
| Virus Strains | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Animals | |||
| C57BL/6J wild type | Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Emx1-Cre | The Jackson Laboratory | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh Lab | ||
| Software | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | National Instruments | ||
| MATLAB | Mathworks |
Referências
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