Calciumbilleddannelse i mus overlegen colliculus
Summary
Denne protokol beskriver proceduren for billeddannelse af calciumresponser i den overlegne colliculus (SC) hos vågne mus, herunder billeddannelse af enkeltneuronaktivitet med to-fotonmikroskopi, mens cortex efterlades intakt i vildtypemus, og billeddannelse af hele SC med vidvinkelmikroskopi i delvis cortex-mutante mus.
Abstract
Den overlegne colliculus (SC), en evolutionært bevaret midterhjernestruktur hos alle hvirveldyr, er det mest sofistikerede visuelle center før fremkomsten af hjernebarken. Den modtager direkte input fra ~ 30 typer retinale ganglionceller (RGC’er), hvor hver koder for en specifik visuel funktion. Det er fortsat uklart, om SC blot arver retinale træk, eller om der forekommer yderligere og potentielt de novo-behandling i SC. For at afsløre den neurale kodning af visuel information i SC giver vi her en detaljeret protokol til optisk registrering af visuelle reaktioner med to komplementære metoder i vågne mus. Den ene metode bruger to-fotonmikroskopi til at afbilde calciumaktivitet ved enkeltcelleopløsning uden at ablere den overliggende cortex, mens den anden bruger vidvinkelmikroskopi til at afbilde hele SC af en mutant mus, hvis cortex stort set er uudviklet. Denne protokol beskriver disse to metoder, herunder dyreforberedelse, viral injektion, hovedpladeimplantation, stikimplantation, dataindsamling og dataanalyse. De repræsentative resultater viser, at to-foton calciumbilleddannelse afslører visuelt fremkaldte neuronale reaktioner ved enkeltcelleopløsning, og wide-field calciumbilleddannelse afslører neural aktivitet på tværs af hele SC. Ved at kombinere disse to metoder kan man afsløre den neurale kodning i SC på forskellige skalaer, og en sådan kombination kan også anvendes på andre hjerneområder.
Introduction
Den overlegne colliculus (SC) er et vigtigt visuelt center hos alle hvirveldyr. Hos pattedyr modtager den direkte input fra nethinden og den visuelle cortex1. Mens optisk optagelse er blevet anvendt i vid udstrækning på cortex 2,3,4,5, hindres dens anvendelse i SC af dårlig optisk adgang 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. Målet med denne protokol er at give detaljer om to komplementære metoder til optisk optagelse af den neurale aktivitet i SC.
SC er placeret under cortex og tværgående sinus, hvilket begrænser optisk adgang til de kollikulære neuroner. En metode til at overvinde denne begrænsning er at aspirere den overliggende cortex og udsætte den forreste laterale SC 7,9,10,13,14,19. Men fordi SC modtager kortikale input, kan en sådan operation påvirke, hvordan SC-neuronerne reagerer på visuelle stimuli. For at overvinde denne begrænsning beskriver vi her en alternativ protokol til at afbilde det overfladiske lag af den bageste mediale SC med et siliciumstik, mens cortex forbliver intakt 8,11. Specifikt for at opnå enkeltcelleopløsning anvendte vi to-fotonmikroskopi til billedcalciumresponser i den bageste mediale SC hos vildtypemus. For at opnå bred dækning anvendte vi desuden vidvinkelmikroskopi til at afbilde hele SC af en mutant mus, hvis bageste cortex ikke har udviklet20.
De to metoder, der er beskrevet i denne protokol, supplerer hinanden. To-foton calciumbilleddannelse uden ablering af cortex er egnet til registrering af neural aktivitet ved enkeltcelleopløsning med intakte kortikale indgange. Wide-field calciumbilleddannelse er velegnet til registrering af neural aktivitet i hele SC, mens den rumlige opløsning ofres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i protokollen
Det mest kritiske trin er kraniotomien i trin 5.2 og 5.3. For det første er knoglen 0,5 mm bagved lambdaen tyk og har blodkar indeni, hvilket kan forårsage blødning under boreprocessen. Tilstrækkeligt gelskum bør være forberedt for at stoppe blødningen. For det andet er der en god chance for angiorrhexis, når knoglen fjernes lige over den tværgående sinus. Til fejlfinding er en alternativ tilgang at tynde knoglen inde i ovalen og fjerne den stykke for stykke. Et a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af National Natural Science Foundation of China (32271060). Y.-t.L. designede forskningen, udførte eksperimentet, analyserede dataene og skrev manuskriptet. Z.L. og R.W. udførte eksperimentet.
Materials
| 16x objective | Nikon | ||
| 50-mm lens | Computar | M5018-MP2 | |
| 5-mm coverslip | Warner instruments | CS-5R | |
| bandpass filter | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| butyl cyanoacrylate | Vetbond, World Precision Instruments | ||
| camera for monitoring pupil | FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | |
| camera for widefield imaging | Basler | acA2000-165µm | |
| corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| dichroic | Chroma Technology | T600/200dcrb | |
| galvanometers | Cambridge Technology | ||
| glass bead sterilizer | RWD | RS1502 | |
| microdrill | RWD | 78001 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | QUAD | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu | R3896 | |
| rotory encoder | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| self-curing dental adhesive resin cement | SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan | ||
| thermostatic heating pad | RWD | 69020 | |
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| translucent silicone adhesive | Kwik-Sil, World Precision Instruments | ||
| treadmill | Xinglin Biology | ||
| Virus Strains | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Animals | |||
| C57BL/6J wild type | Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Emx1-Cre | The Jackson Laboratory | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh Lab | ||
| Software | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | National Instruments | ||
| MATLAB | Mathworks |
Referências
- May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
- Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
- de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
- Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
- Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
- Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
- de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
- Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
- Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
- Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
- Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
- Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
- Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
- Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
- Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
- Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
- Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
- Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
- Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).
