تصوير الكالسيوم في القولون العلوي للفأر
Summary
يفصل هذا البروتوكول الإجراء الخاص بتصوير استجابات الكالسيوم في القولون العلوي (SC) للفئران المستيقظة ، بما في ذلك تصوير نشاط الخلايا العصبية المفردة باستخدام المجهر ثنائي الفوتون مع ترك القشرة سليمة في الفئران البرية ، وتصوير SC بأكمله بالمجهر واسع المجال في الفئران الطافرة ذات القشرة الجزئية.
Abstract
القولون العلوي (SC) ، وهو هيكل دماغي متوسط محفوظ تطوريا في جميع الفقاريات ، هو المركز البصري الأكثر تطورا قبل ظهور القشرة الدماغية. يتلقى مدخلات مباشرة من ~ 30 نوعا من خلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، مع كل ترميز ميزة بصرية محددة. لا يزال من بعيد المنال ما إذا كان SC يرث ببساطة ميزات الشبكية أو إذا حدثت معالجة إضافية وربما جديدة في SC. للكشف عن الترميز العصبي للمعلومات المرئية في SC ، نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لتسجيل الاستجابات المرئية بصريا بطريقتين متكاملتين في الفئران المستيقظة. تستخدم إحدى الطرق الفحص المجهري ثنائي الفوتون لتصوير نشاط الكالسيوم بدقة خلية واحدة دون إزالة القشرة المتراكبة ، بينما تستخدم الطريقة الأخرى الفحص المجهري واسع المجال لتصوير SC بالكامل للفأر الطافر الذي تكون قشرته غير متطورة إلى حد كبير. يفصل هذا البروتوكول هاتين الطريقتين ، بما في ذلك تحضير الحيوانات ، والحقن الفيروسي ، وزرع الألواح الأمامية ، وزرع السدادة ، والحصول على البيانات ، وتحليل البيانات. تظهر النتائج التمثيلية أن تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون يكشف عن استجابات عصبية مستثارة بصريا بدقة خلية واحدة ، ويكشف تصوير الكالسيوم واسع المجال عن النشاط العصبي عبر SC بأكمله. من خلال الجمع بين هاتين الطريقتين ، يمكن للمرء أن يكشف عن الترميز العصبي في SC بمقاييس مختلفة ، ويمكن أيضا تطبيق هذا المزيج على مناطق الدماغ الأخرى.
Introduction
القولون العلوي (SC) هو مركز بصري مهم في جميع الفقاريات. في الثدييات ، يتلقى مدخلات مباشرة من شبكية العين والقشرة البصرية1. بينما تم تطبيق التسجيل البصري على نطاق واسع على القشرة2،3،4،5 ، فإن تطبيقه في SC يعوقه ضعف الوصول البصري6،7،8،9،10،11،12،13،14،15،16،17، 18,19. الهدف من هذا البروتوكول هو تقديم تفاصيل حول طريقتين تكميليتين للتسجيل البصري للنشاط العصبي في SC.
يقع SC تحت القشرة والجيب المستعرض ، مما يحد من الوصول البصري إلى الخلايا العصبية الغروية. تتمثل إحدى الطرق للتغلب على هذا القيد في استنشاق القشرة المتراكبة وكشف SCالأمامي الجانبي 7،9،10،13،14،19. ومع ذلك ، نظرا لأن SC يتلقى مدخلات قشرية ، فقد تؤثر مثل هذه العملية على كيفية استجابة الخلايا العصبية SC للمنبهات البصرية. للتغلب على هذا القيد ، نوضح هنا بروتوكولا بديلا لتصوير الطبقة السطحية من SC الخلفي الإنسي بسدادة سيليكون ، مع ترك القشرة سليمة 8,11. على وجه التحديد ، لتحقيق دقة خلية واحدة ، قمنا بتطبيق المجهر ثنائي الفوتون لتصوير استجابات الكالسيوم في SC الخلفي الإنسي للفئران البرية. بالإضافة إلى ذلك ، لتحقيق تغطية واسعة ، قمنا بتطبيق الفحص المجهري واسع المجال لتصوير SC بالكامل لفأر متحور لم تتطور قشرته الخلفية20.
الطريقتان الموصوفتان في هذا البروتوكول متكاملتان لبعضهما البعض. يعد تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون دون إزالة القشرة مناسبا لتسجيل النشاط العصبي بدقة خلية واحدة مع مدخلات قشرية سليمة. يعد تصوير الكالسيوم واسع المجال مناسبا لتسجيل النشاط العصبي في SC بأكمله مع التضحية بالدقة المكانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
الخطوة الأكثر أهمية هي حج القحف في الخطوتين 5.2 و 5.3. أولا ، العظم عند 0.5 مم خلف لامدا سميك ويحتوي على أوعية دموية بداخله ، مما قد يسبب النزيف أثناء عملية الحفر. يجب تحضير رغوة هلام كافية لوقف النزيف. ثانيا ، هناك فرصة جيدة للإصابة بالتهاب الأوعية الدمو…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32271060). صمم Y.-t.L. البحث ، وأجرى التجربة ، وحلل البيانات ، وكتب المخطوطة. أجرى Z.L. و R.W. التجربة.
Materials
| 16x objective | Nikon | ||
| 50-mm lens | Computar | M5018-MP2 | |
| 5-mm coverslip | Warner instruments | CS-5R | |
| bandpass filter | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| butyl cyanoacrylate | Vetbond, World Precision Instruments | ||
| camera for monitoring pupil | FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | |
| camera for widefield imaging | Basler | acA2000-165µm | |
| corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| dichroic | Chroma Technology | T600/200dcrb | |
| galvanometers | Cambridge Technology | ||
| glass bead sterilizer | RWD | RS1502 | |
| microdrill | RWD | 78001 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | QUAD | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu | R3896 | |
| rotory encoder | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| self-curing dental adhesive resin cement | SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan | ||
| thermostatic heating pad | RWD | 69020 | |
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| translucent silicone adhesive | Kwik-Sil, World Precision Instruments | ||
| treadmill | Xinglin Biology | ||
| Virus Strains | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Animals | |||
| C57BL/6J wild type | Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Emx1-Cre | The Jackson Laboratory | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh Lab | ||
| Software | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | National Instruments | ||
| MATLAB | Mathworks |
Referências
- May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
- Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
- de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
- Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
- Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
- Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
- de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
- Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
- Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
- Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
- Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
- Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
- Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
- Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
- Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
- Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
- Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
- Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
- Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).
