Den nåværende protokollen oppdaterer tidligere protokoller og inkorporerer relativt enkle tilnærminger for dyrking av høykvalitets cochlea-eksplanter. Dette gir pålitelig datainnsamling og høyoppløselig avbildning i levende og faste celler. Denne protokollen støtter den pågående trenden med å studere indre øreceller.
Ubehandlet hørselstap påfører det globale helsevesenet betydelige kostnader og svekker enkeltpersoners livskvalitet. Sensorinevralt hørselstap er preget av kumulativt og irreversibelt tap av sensoriske hårceller og hørselsnerver i cochlea. Hele og vitale cochleaeksplanter er et av de grunnleggende verktøyene i hørselsforskning for å oppdage tap av hårceller og for å karakterisere molekylære mekanismer i de indre ørecellene. For mange år siden ble det utviklet en protokoll for neonatal cochleaisolasjon, og selv om den har blitt modifisert over tid, har den fortsatt potensial for forbedring.
Denne artikkelen presenterer en optimalisert protokoll for isolering og dyrking av hele neonatale cochlea-eksplanter i flerbrønnskulturkamre som muliggjør studier av hårceller og spiralganglionnevronceller langs hele lengden av sneglehuset. Protokollen ble testet ved hjelp av cochlea-eksplanter fra mus og rotter. Friske cochlea-eksplanter ble oppnådd for å studere samspillet mellom hårceller, spiralganglionnevronceller og de omkringliggende støttecellene.
En av hovedfordelene med denne metoden er at den forenkler orgelkulturtrinnene uten at det går ut over kvaliteten på eksplantene. Alle tre svingene på Corti-organet er festet til bunnen av kammeret, noe som letter in vitro-eksperimenter og den omfattende analysen av eksplantene. Vi gir noen eksempler på cochleabilder fra ulike eksperimenter med levende og faste eksplanter, og viser at eksplantene beholder sin struktur til tross for eksponering for ototoksiske stoffer. Denne optimaliserte protokollen kan brukes mye til integrativ analyse av pattedyrscochlea.
De fleste tilfeller av sensorinevralt hørselstap skyldes degenerasjon av sensoriske hårceller, auditive nerveceller og/eller auditive synapser1. Denne degenerative prosessen i sanseceller er progressiv og vanligvis irreversibel, noe som resulterer i hørselstap2. Derfor er informasjon om sanseceller levedyktighet og endringer i signalveier under stressforhold avgjørende for å beskytte cellene mot skade og dermed tap. Undersøkelsen av cochleære eksplanter i kultur tillater rekapitulering av vevskomplekset og vedlikehold av et normalt celle-cellenettverk, noe som muliggjør en bedre beskrivelse av signaleringsprosessene. For å etablere eksperimentelle modeller for ototoksisitet har antibiotikumet gentamicin og kjemoterapeutisk middel cisplatin ofte blitt brukt, fordi de er kjent for å ha ototoksiske bivirkninger3.
In vitro-dyrkningssystemer av cochlea-eksplanter har blitt utviklet og modifisert over tid. Imidlertid mangler en beskrivelse av den trinnvise protokollen for kulturen til hele cochlea-eksplanter ofte i flere publikasjoner. En av de første videoprotokollene for primærkulturen til murinorganet Corti ble publisert av Parker et al., der forfatterne beskrev trinnene for isolering av sensorisk epitel, dyrking på glassdeksel og elektroporering av eksplanter for transfeksjonseksperimenter4. En annen protokoll ved bruk av glassdeksel ble også tidligere publisert, der organisering av cellulær struktur i det indre øret ble vurdert5. En alternativ protokoll som bruker Millicell-membran for kulturen av museeksplanter av organet Corti og vestibulært organ er rapportert6. Disse videorapportene har bidratt til å forbedre metoden, men det er fortsatt utfordringer som må løses. For å løse en rekke problemer som oppstår ved bruk av glassdeksler og innsatser, tar denne protokollen sikte på å strømlinjeforme orgelkulturtrinnene og dyrke organer av høy kvalitet for pålitelige data. Dette oppnås ved å minimere den direkte håndteringen av orgelet under eksperimentelle prosedyrer og unngå organoverføring før man oppnår høyoppløselige bilder av levende og faste celler.
Den nåværende protokollen oppdaterer tidligere publiserte in vitro-kultursystemer og introduserer flere optimaliseringer i isolasjonen av Corti-organet og overføring til kulturkamrene, samt integrering av et nytt lysbildekammer for å forbedre kulturforholdene og videre analyse. Denne optimaliserte protokollen reduserer risikoen for å skade orgelet, noe som kan oppstå ved bruk av glassdeksler under mediumendringen eller under overføring av orgelet fra dekkslips eller membraner for videre analyse 4,5,6. Glassdekslene har en bedre reflekterende indeks enn plastene; De er imidlertid skjøre og kan bryte lettere. Flerbrønnskamrene som brukes her er festet til et mikroskopglass, som er godt egnet for orgelkultur og for høyoppløselig avbildning. Overføringen av de isolerte organene utføres med en slikkepott, som gjør at orgelet kan bringes i riktig retning og gli inn i kammeret, i stedet for å påføre kraft med en pipette som tidligere anbefalt 4,5,6.
De poly-D-lysinbelagte flerbrønnskamrene, som skal inneholde tilstrekkelig medium, letter organoverføringen og riktig posisjonering av eksplantene uten å påføre klebende trykk og samtidig unngå organoverlapping, som nevnt tidligere6. I tillegg løses utilsiktede organoverlappende og ujevne strukturer ved hjelp av en konfokal Z-stabel. Denne protokollen er optimalisert for ulike applikasjoner, for eksempel muse- og rotteplanter, eksplanter av organet til Corti og cochlea, kultur i serumholdig og serumfritt medium, ototoksiske vurderinger og generelle legemiddelresponseksperimenter. Cochlea-eksplantene monteres og inkuberes i kamre med dekkbunn, noe som letter vedheftingen av cochlea-eksplantene til kamrene for optimal håndtering under in vitro-eksperimentene , etterbehandlingen av eksplantene og avbildning av levende og faste cochleaeksplanter. Visualiseringen av hele lengden av Corti-organet og kvantifiseringen av hårceller er strømlinjeformet. I tillegg er vurderingene av støttecellene, spiral ganglionnevronceller og nevritter nøyaktige. Derfor kan denne protokollen brukes til en omfattende analyse av pattedyrs cochleaceller.
Hensikten med å oppdatere denne protokollen var å strømlinjeforme trinnene fra isolering av eksplantene til avbildning av levende og faste cochleaceller. Vi forbedret noen trinn under isolasjonen og introduserte noen innovative verktøy med sikte på å etablere en effektiv og jevn løpende protokoll for å oppnå eksplanter av høy kvalitet. Metoden som beskrives er en optimalisert protokoll fra tidligere rapporter 4,5. I tillegg mangler noen aktuelle studier en trinnvis oppdatert protokoll. Med forenklede eksplantkulturtrinn gir denne protokollen enkel håndtering av godt bevarte eksplanter, noe som er avgjørende for reproduserbare data. Innføringen av flerbrønnskamre med en polymerdeksel for indre øreeksplanter forbedrer organfestet og bevaring av intakte eksplanter. Her presenterer vi flere eksempler på eksperimenter under stressforhold for å demonstrere at organene i kultur opprettholder sin cellulære organisasjon til tross for tap av hårceller og skade på nevrittene.
En av utfordringene ved dyrking av indre øreorganer er å unngå løsrivelse og flyt av organene, da dette påvirker integriteten til eksplantene, responsen på behandlingen og de påfølgende undersøkelsene. Tidligere ble eksplanter dyrket på glassomslag 4,5. Selv om dyrkning på glassflater ser ut til å være et godt alternativ, er belegg av glasset tidkrevende, og selve dekslene er skjøre og delikate. En alternativ protokoll ved hjelp av Millicell cellekultur setter inn forsøk på å løse dette problemet6. Å kutte og overføre membranen med eksplantene ser imidlertid ut til å være et delikat skritt i den protokollen. I tillegg kan eksplantene bli skadet under montering og tetting av dekselet. I vår foreslåtte tilnærming, når eksplantene er overført til poly-D-lysinbelagte kamre og plassert i riktig posisjon, er det ikke nødvendig med ytterligere overføring eller tildekking med deksel. En annen fordel med denne protokollen er bruken av kamre med et tynt gasspermeabelt polymerdeksel som gir optimale kulturforhold for organeksplantene. Denne polymeren har en optisk kvalitet som ligner på glass, noe som gjør den egnet for celleavbildning i høyoppløselig mikroskopi.
Tilsetning av serum til mediet brukes i de fleste protokoller for celle- og vevskultur, inkludert kulturen av indre øreeksplanter med 1% -10% FBS 4,5,6,16. Tilstedeværelsen av serum påvirker kulturbetingelsene for forsøkene; I visse situasjoner foretrekkes derfor kultur uten serum. Fraværet av serum i kulturen av cochleære eksplanter ble erstattet enten ved tilsetning av N2 til DMEM eller ved tilsetning av N2 til Neurobasal-A medium 5,6. I den forbindelse testet vi dyrkningsforholdene til eksplantene med og uten serum. Under begge tilstandene var de indre ørecellene vitale og responderte på ototoksiske tilstander. Vi testet disse forholdene i 72 timer, men eksplantene kan opprettholdes i kultur enda lenger, spesielt når de inkuberes med serumfritt medium sammen med N2, B27 og vekstfaktorer, som foreslått i andre studier 5,16.
I tillegg til de generelle kritiske trinnene i isoleringen av indre øreeksplanter, som varigheten av organisolasjonen og antibiotika som brukes, er det også noen kritiske trinn i denne protokollen, som imidlertid er håndterbare. Et av de kritiske trinnene i denne metoden er relatert til volumet av medium som forblir i kammeret etter at orgelet er satt inn. Dette er optimalisert for å holde eksplantene i live og festet til bunnflaten. Et annet kritisk skritt er relatert til inkubasjonstiden som kreves for å tillate eksplantene å feste seg til bunnen av kammeret. Inkubasjonstider lengre enn 2 timer med noen få mikroliter medium kan påvirke helsen til eksplantene. Kortere inkubasjonstider, for eksempel 1 time, kan også brukes, så lenge det tas hensyn til ikke å løsne eksplantene. Et annet viktig aspekt er rester av poly-D-lysin. Vasketrinnene av poly-D-lysin bør følges nøye, fordi rester av bromidsaltet av poly-D-lysin kan være giftig for cellene. Etter at vasketrinnene er fulgt nøyaktig, letter belegget med poly-D-lysin den jevne adhesjonen av eksplantene til kamrene slik at posisjonen kan korrigeres før de blir godt festet til bunnen av kammeret.
En av begrensningene ved denne metoden er avbildning av celler ved hjelp av oppreist mikroskopi. Dette kan være et viktig tema for de laboratoriene med inverterte mikroskoper. Glassglass med avtagbare silikonkamre kan brukes til oppreist og invertert mikroskopi; Imidlertid må våre beleggforhold med poly-D-lysin testes først. En ytterligere begrensning er lagringen av kamrene, fordi innsatsene ikke kan fjernes, og den totale høyden på ett kammer med lokket er nesten 11 mm sammenlignet med 1 mm høyden på et standard mikroskopglass. Imidlertid bruker 8-brønnskammeret mindre plass enn 4-brønnsplatene som ble foreslått før16.
Vi presenterer her bilder ervervet med to mikroskoper. Mens punktskanning konfokalmikroskop gir høyoppløselige bilder av vev på grunn av sin tynne optiske seksjon, gir spinndiskens konfokalmikroskop en raskere bildetid med god oppløsning. Stereocilia av indre hårceller (IHC) og ytre hårceller (OHC) visualiseres ved hjelp av konfokal mikroskopi. Siden stereocilia av IHC er større enn OHCs, ble de gjentatte ganger og godt visualisert i dette arbeidet. For OHC stereocilia, kan andre alternative mikroskoper forbedre visualiseringen, for eksempel super-oppløsning mikroskopi (SRM). Eksplantbildene som er tatt med spinnskivemikroskopet, er tilstrekkelige for enkel integrering av automatisert hårcelletelling ved hjelp av en dyp læringsmetode12. Videre er den korte innsamlingstiden viktig for eksperimenter med levende celler og vev. I tillegg er denne protokollen ikke begrenset til neonatale cochleaeksplanter. Med noen optimaliseringer kan andre eksplanter som vestibulære organer eller embryonale vev også dyrkes.
Kvantifiseringen av cochleaceller, som hårceller og nevroner, in vitro er viktig for å vurdere cellens levedyktighet og dermed prosentandelen skadede eller tapte celler. Undersøkelser av signalveier og cellefunksjoner bidrar til å avsløre mekanismene for død og overlevelse. Undersøkelser av embryonale og neonatale cochleære vev er nyttige for å undersøke utviklingsstadiene i cochlea. Derfor vil denne protokollen bidra til å optimalisere in vitro-studier av indre øreeksplanter, for eksempel for å etablere ototoksiske modeller, undersøke utviklingsstadier, evaluere signalveier og utføre legemiddelscreeningsstudier.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å anerkjenne dyreavdelingen ved Institutt for biomedisin ved Universitetet i Basel for deres støtte til dyrepleie, mikroskopikjernefasilitetene samt informasjonsteknologitjenesten ved Institutt for biomedisin for teknisk assistanse og Swiss National Science Foundation (SNSF) for økonomisk støtte (MD-PhD-stipend til MC, tilskuddsnummer 323530_191222).
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
microscope | LEICA | M80 | |
microscope | LEICA | MS5 | |
MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |