صياغة وتوصيف العوامل النشطة بيولوجيا المحتوية على أقراص نانوية

البروتينات الدهنية عالية الكثافة القرصية الوليدة (HDLs) هي أسلاف تحدث بشكل طبيعي ل HDL الكروي الأكثر وفرة الموجود في الدورة الدموية البشرية. هذه الجسيمات الوليدة ، التي يشار إليها أيضا باسم HDL pre-ß ، تمتلك خصائص هيكلية فريدة ومميزة¹. في الواقع ، بدلا من الوجود كجسيم كروي ، فإن HDLs الوليدة على شكل قرص. كشفت دراسات التوصيف الهيكلي المكثفة على HDLs القرصية الطبيعية والمعاد تشكيلها أنها تتكون من طبقة ثنائية فوسفوليبيد محيطها محاط ببروتين شحمي برمائي قابل للتبادل (apo) ، مثل apoA-I. في استقلاب البروتين الدهني البشري ، تتراكم HDLs الوليدة المنتشرة الدهون من الخلايا المحيطية وتنضج إلى HDLs كروية في عملية تعتمد على وسطاء البروتين الرئيسيين ، بما في ذلك ناقل الكاسيت المرتبط ATP A1 والليسيثين: الكوليسترول acyltransferse². تمثل هذه العملية مكونا مهما في مسار نقل الكوليسترول العكسي الذي يعتبر وقائيا ضد أمراض القلب. مسلحين بهذه المعرفة والقدرة على إعادة تكوين HDLs القرصية ، استخدم الباحثون هذه الجسيمات كتدخل علاجي لعلاج تصلب الشرايين³. في جوهرها ، فإن ضخ HDL المعاد تشكيله (rHDL) في المرضى يعزز تدفق الكوليسترول من رواسب البلاك ويعيده إلى الكبد لتحويله إلى الأحماض الصفراوية وإفرازه من الجسم. تتبع العديد من شركات التكنولوجيا الحيوية / الأدوية استراتيجية العلاج^{هذه 4}.

في الوقت نفسه ، أثارت القدرة على توليد هذه الجسيمات في المختبر موجة من الأنشطة البحثية التي أدت إلى تطبيقات جديدة وتقنيات جديدة. يتضمن أحد التطبيقات البارزة استخدام جزيئات rHDL كغشاء مصغر لإيواء البروتينات عبر الغشاء في بيئة شبيهة بالسكان^{الأصليين 5}. حتى الآن ، تم دمج مئات البروتينات بنجاح في rHDL القرصي ، وأظهرت الأبحاث أن هذه البروتينات تحتفظ بكل من التشكل الأصلي والنشاط البيولوجي كمستقبلات وإنزيمات وناقلات ، إلخ. كما ثبت أن هذه الجسيمات ، التي يشار إليها باسم “الأقراص النانوية” ، قابلة للتوصيف الهيكلي ، غالبا بدقة^{عالية 6}. من المسلم به أن هذا النهج في التحقيقات في البروتينات عبر الغشاء متفوق على الدراسات التي أجريت على مذيلات المنظفات أو الجسيمات الشحمية ، ونتيجة لذلك ، يتقدم بسرعة. من المهم أن ندرك أنه تم الإبلاغ عن طريقتين متميزتين قادرتين على تشكيل rHDL. طريقة “غسيل الكلى cholate”¹³ شائعة للتطبيقات المتعلقة بدمج البروتينات عبر الغشاء في طبقة rHDL^{ثنائية الطبقة 5}. بشكل أساسي ، تتضمن طريقة الصياغة هذه خلط طبقة ثنائية تشكل الفوسفوليبيد ، وبروتين سقالة ، وبروتين عبر الغشاء مهم في مخزن مؤقت يحتوي على كولات الصوديوم المنظف (أو ديوكسي كولات الصوديوم ؛ الوزن الجزيئي للمذيلة [MW] من 4200 Da). يعمل المنظف على إذابة مكونات التفاعل المختلفة بشكل فعال ، مما يسمح بغسيل العينة ضد المخزن المؤقت الذي يفتقر إلى المنظفات. أثناء خطوة غسيل الكلى ، عند إزالة المنظف من العينة ، يتشكل rHDL تلقائيا. عندما يتم استخدام هذا النهج لمحاصرة بروتين عبر الغشاء محل الاهتمام ، فقد تم تسمية جزيئات المنتج بالأقراص النانوية⁵. ومع ذلك ، فإن محاولات استخدام هذه الطريقة لدمج العوامل النشطة بيولوجيا الكارهة للماء ذات الجزيئات الصغيرة (MW <1000 Da) ، لم تنجح إلى حد كبير. على عكس البروتينات عبر الغشاء ، فإن العوامل النشطة بيولوجيا للجزيئات الصغيرة قادرة على الهروب من كيس غسيل الكلى مع المنظف ، مما يقلل بشكل كبير من كفاءة دمجها في rHDLs. تم حل هذه المشكلة عن طريق حذف المنظفات من خليط التركيبة¹⁴. بدلا من ذلك ، تتم إضافة المكونات إلى مخزن مائي بالتتابع ، بدءا من الطبقة الثنائية المكونة للدهون ، مما يشكل عاملا نشطا بيولوجيا مستقرا يحتوي على rHDL ، يشار إليه باسم القرص النانوي. استخدم آخرون rHDL لدمج ونقل عوامل التصوير في الجسم الحي ⁷. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام rHDL المتخصصة المكونة من سقالة البروتين الشحمي والدهون الغليسيروفوسفوليبيد الأنيونية ، الكارديوليبين ، في دراسات ربط اليجند. توفر هذه الجسيمات منصة لدراسات تفاعل الكارديوليبين مع مختلف الروابط القابلة للذوبان في الماء ، بما في ذلك الكالسيوم والسيتوكروم ج والعامل المضاد للسرطان دوكسوروبيسين⁸.

ينصب تركيز هذه الدراسة على صياغة rHDL التي تمتلك عاملا نشطا بيولوجيا مسعورا مدمجا بشكل مستقر (أي قرص نانوي). إن قدرة هذه العوامل على الاندماج في الوسط الدهني لجزيئات rHDL القرصية تمنحها بشكل فعال قابلية الذوبان المائي. على هذا النحو ، فإن الأقراص النانوية لديها القدرة على التطبيقات العلاجية في الجسم الحي . عند صياغة الأقراص النانوية ، يلزم وجود ظروف حضانة / تفاعل محددة لدمج العوامل النشطة بيولوجيا المنفصلة الكارهة للماء بنجاح في جسيم المنتج ، والهدف من هذا التقرير هو توفير معلومات عملية مفصلة يمكن استخدامها كقالب أساسي لإنشاء جزيئات نانوية جديدة لتطبيقات محددة. وبالتالي ، في سياق هذه المخطوطة ، فإن المصطلحين nanodisc و nanodisk غير قابلين للتبادل. في حين يشير القرص النانوي إلى rHDL المركب ليحتوي على بروتين عبر الغشاء مضمن في طبقة الدهون^{المزدوجة 5} ، يشير مصطلح nanodisk إلى rHDL المصمم لدمج عوامل نشطة بيولوجيا منخفضة الوزن الجزيئي (< 1000 Da) ، مثل الأمفوتريسين B¹⁴.

تتوفر مجموعة متنوعة من الطرق للحصول على بروتينات سقالة مناسبة. من الممكن شراء بروتينات سقالة من الشركات المصنعة [مثل apoA-I (SRP4693) أو apoE4 (A3234)] ، ومع ذلك ، قد تكون التكلفة عاملا مقيدا. النهج المفضل هو التعبير عن بروتينات السقالة المؤتلفة في الإشريكية القولونية. يتم نشر البروتوكولات للإنسان apoA-I⁹ ، apoE4¹⁰ ، وكذلك بروتين الهيموليمف الحشري apolipophorin-III¹¹. لغرض التجارب الموصوفة هنا ، تم استخدام مجال apoE4 N-terminal (NT) البشري المؤتلف (الأحماض الأمينية 1-183). تم تصنيع تسلسل النوكليوتيدات الذي يشفر apoE4-NT البشري وإدخاله في متجه تعبير pET-22b (+) مجاور مباشرة لتسلسل قائد pelB المشفر بالمتجهات. يؤدي هذا البناء إلى التعبير عن بروتين اندماج تسلسل pelB – apoE4-NT. بعد تخليق البروتين ، يوجه تسلسل قائد pelB البكتيري البروتين المركب حديثا إلى الفضاء المحيطي حيث يشق الببتيداز القائد تسلسل pelB. بروتين apoE4-NT الناتج ، بدون علامات تسلسل أو ذيول ، يهرب لاحقا من البكتيريا ويتراكم في وسط الاستزراع^11,12 ، مما يبسط المعالجة النهائية.