Ce protocole décrit la microinjection et l’électroporation in vivo pour l’édition du génome médiée par CRISPR restreinte régionalement dans l’oviducte de souris.
Les modèles murins génétiquement modifiés de la lignée germinale (G-GEMM) ont fourni des informations précieuses sur la fonction des gènes in vivo dans le développement, l’homéostasie et la maladie. Cependant, le temps et les coûts associés à la création et à l’entretien des colonies sont élevés. Les progrès récents dans l’édition du génome médiée par CRISPR ont permis la génération de GEMM somatiques (S-GEMM) en ciblant directement la cellule/tissu/organe d’intérêt.
L’oviducte, ou trompe de Fallope chez l’homme, est considéré comme le tissu d’origine du cancer de l’ovaire le plus courant, les carcinomes séreux de l’ovaire de haut grade (HGSC). Les HGSC prennent naissance dans la région de la trompe de Fallope distale à l’utérus, située à côté de l’ovaire, mais pas dans la trompe de Fallope proximale. Cependant, les modèles murins traditionnels de HGSC ciblent l’ensemble de l’oviducte et ne récapitulent donc pas la condition humaine. Nous présentons une méthode de microinjection de solution d’ADN, d’ARN ou de ribonucléoprotéine (RNP) dans la lumière de l’oviducte et d’électroporation in vivo pour cibler les cellules épithéliales muqueuses dans des régions restreintes le long de l’oviducte. Cette méthode présente plusieurs avantages pour la modélisation du cancer, tels que 1) une grande adaptabilité dans le ciblage de la zone/tissus/organe et de la région d’électroporation, 2) une grande flexibilité dans les types cellulaires ciblés (pliance cellulaire) lorsqu’elle est utilisée en combinaison avec des promoteurs spécifiques pour l’expression de Cas9, 3) une grande flexibilité dans le nombre de cellules électroporées (fréquence relativement faible), 4) aucune lignée de souris spécifique n’est requise (modélisation immunocompétente de la maladie), 5) une grande flexibilité dans la combinaison de mutations génétiques et 6) la possibilité de suivre les cellules électroporées lorsqu’elles sont utilisées en combinaison avec une lignée rapporteur Cre. Ainsi, cette méthode rentable récapitule l’initiation du cancer humain.
La trompe de Fallope, appelée oviducte chez la souris, est une structure tubulaire qui relie l’utérus à l’ovaire. Il joue un rôle essentiel dans la reproduction des mammifères, fournissant un environnement propice à la fécondation interne et au développement préimplantatoire 1,2. Malgré son importance, on sait peu de choses sur sa fonction et son homéostasie, en partie grâce au développement de techniques de fécondation in vitro contournant tout problème d’infertilité lié à cet organe3. Cependant, il a été reconnu que les lésions précancéreuses du carcinome séreux de l’ovaire de haut grade (HGSC), un histotype agressif du cancer de l’ovaire qui représente environ 75% des carcinomes ovariens et 85% des décès connexes4, sont limitées à l’épithélium distal des trompes de Fallope 5,6,7,8 . Cela indique que toutes les cellules de notre corps ne sont pas également sensibles aux agressions oncogéniques, mais que seules les cellules uniques / sensibles de chaque tissu / organe deviennent la cellule d’origine du cancer – appelée pliance cellulaire9. Dans le même ordre d’idées, il a été démontré que les cellules épithéliales de la trompe de Fallope distale, situées à côté de l’ovaire, sont distinctes du reste de la trompe10,11. Ainsi, les modèles murins traditionnels de HGSC, qui ciblent toutes les cellules de l’oviducte, ne récapitulent pas la condition humaine. Dans une étude récente, nous avons utilisé une combinaison d’édition du génome médiée par CRISPR, d’électroporation in vivo de l’oviducte et de traçage de lignée basé sur Cre pour induire avec succès HGSC en mutant quatre gènes suppresseurs de tumeurs dans l’oviducte distalde souris 12,13. Ce manuscrit présente un protocole étape par étape décrivant cette procédure de microinjection et d’électroporation in vivo pour cibler l’épithélium muqueux oviducte de souris.
Cette méthode présente plusieurs avantages. Il peut être adapté pour cibler d’autres tissus/organes, y compris le parenchymed’organe 14. Bien que d’autres approches d’administration de gènes in vivo telles que les systèmes lentiviraux et adénoviraux puissent être utilisées pour obtenir un ciblage similaire spécifique aux tissus / organes, la zone de ciblage est plus facilement ajustée à l’aide de différentes tailles d’électrodes de type pince à épiler pour une administration basée sur l’électroporation. Selon la concentration d’ADN/ARN/ribonucléoprotéines (RNP), les paramètres d’électroporation et la taille des électrodes, le nombre de cellules électroporées peut être modifié. De plus, des types de cellules spécifiques peuvent être ciblés lorsqu’ils sont utilisés en combinaison avec des promoteurs pour l’expression de Cas9, sans avoir besoin absolu de modèles murins génétiquement modifiés par la lignée germinale (G-GEMM). De plus, contrairement aux systèmes d’administration virale, l’électroporation permet une livraison plasmidique multiple dans des cellules uniques et moins de contrainte dans la taille de l’ADNinséré 15. Le criblage in vivo des mutations génétiques peut également être effectué avec une relative facilité en raison de cette grande flexibilité. De plus, les cellules électroporées peuvent être suivies ou tracées lorsque cette méthode est utilisée en combinaison avec des lignes rapporteures Cre telles que Tdtomato ou Confetti16,17.
Les étapes cruciales de ce protocole détaillé sont la microinjection de solution d’ADN/ARN/PNR dans la lumière oviducte et le contrôle de la force et de la surface d’électroporation. Une fuite de solution d’ADN/ARN/RNP pendant la microinjection peut provoquer la transfection de zones/cellules indésirables. Pour une électroporation constante et efficace, il est préférable de remplir la lumière oviducte avec la solution (Figure 3C,D). En effet, la zone d’électroporation est principalement contrôlée par la taille et le placement des électrodes. Une électroporation faible réduit le nombre de cellules électroporées, et une électroporation brutale peut provoquer l’électroporation de cellules indésirables ou perturber la structure des tissus. Le nombre de cellules électroporées peut être modifié en ajustant la concentration de la solution ADN/ARN/RNP ou les paramètres d’électroporation. Cependant, étant donné que des tensions élevées / production de chaleur pendant l’électroporation pourraient endommager le tissu, ces paramètres doivent être testés avant d’être utilisés sur des souris vivantes / anesthésiées. Enfin, en raison de la nature exigeante de cette procédure, il est recommandé de pratiquer l’exposition des voies et la micro-injection sur des souris mortes avant d’effectuer cette chirurgie sur des souris vivantes / anesthésiées.
Il est reconnu que plusieurs gènes sont impliqués dans l’initiation du cancer, ainsi, la récapitulation de cet événement nécessite une modification multi-allélique de plusieurs gènes. De plus, on sait également que toutes les cellules ne sont pas également sensibles aux mutations oncogènes9. La modélisation du cancer nécessite donc des lignées de souris Cre spécifiques pour obtenir un contrôle étroit des agressions oncogènes. Cependant, leur disponibilité et leur spécificité posent divers défis, notamment des effets sur les tissus non ciblés et la létalité19. De plus, les G-GEMM traditionnels entraînent des coûts de maintenance élevés et nécessitent du temps pour la génération de lignées de souris. Le développement de la technologie d’édition du génome CRISPR / Cas9 et l’amélioration de la livraison de gènes dans des cellules somatiques spécifiques nous ont permis de surmonter ces problèmes. Dans ce protocole, nous présentons une méthode d’administration ADN/ARN/RNP pour la manipulation du génome somatique qui peut être utilisée pour la modélisation du cancer, sans le besoin absolu de lignées de souris spécifiques12. En injectant des solutions d’ADN/ARN/PNR dans la lumière et en utilisant différentes tailles d’électrodes de type pince à épiler pour l’administration basée sur l’électroporation, les zones restreintes de l’épithélium muqueux oviducte de souris sont ciblées (Figure 4A-F). Ceci est particulièrement utile pour modéliser l’initiation des HGSC qui proviennent de l’extrémité distale de la trompe de Fallope.
La méthode de micro-injection et d’électroporation in vivo présentée est très polyvalente pour cibler les tissus/organes avec une lumière. Le parenchyme d’organe peut également être ciblé à l’aide de cette méthode14. Les approches d’administration virale, comme les systèmes lentiviral et adénoviral, peuvent également être utilisées à des fins similaires. Cependant, les avantages de l’électroporation par rapport aux approches d’administration virale sont: 1) l’administration de plasmides multiples dans des cellules individuelles, 2) aucune restriction sur la taille de l’insert15 et 3) un contrôle facile de la zone et du moment de l’accouchement. En outre, la spécificité du ciblage peut être améliorée en utilisant des promoteurs spécifiques à la lignée. Ceci est parfois difficile dans les systèmes viraux en raison de la limite sur l’emballage viral.
Comme c’est la nature de l’électroporation, les cellules épithéliales électroporées sont entrecoupées au hasard de cellules saines non éditées (Figure 4G). Cependant, ce mosaïcisme dans les cellules génétiquement modifiées et non modifiées pourrait être avantageux pour étudier l’initiation du cancer, car il récapitule la nature sporadique de l’initiation précoce du cancer dans un microenvironnement immunocompétent. La fréquence des cellules électroporées peut être ajustée en faisant varier les concentrations de solution ADN/ARN/RNP et/ou les paramètres d’électroporation. En utilisant l’édition de gènes médiée par CRISPR-Cas en combinaison avec le protocole présenté, il est facile de cribler plusieurs gènes et de générer des modèles hétérogènes de mutations / combinaisons alléliques dans des gènes ciblés; ceci est particulièrement utile dans la modélisation des cancers qui présentent un nombre considérable d’altérations génomiques comme HGSC20,21. De plus, en séquençant des gènes ciblés au cours de la progression du cancer, il est possible de suivre l’évolution clonale in vivo des tumeurs et des métastases chez des souris immunocompétentes12.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Katie Teng et le Dr Matthew J. Ford d’avoir fourni des plasmides utilisés pour générer des résultats représentatifs et optimiser le protocole. K.H. a bénéficié d’une subvention de doctorat du Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS), de la Fondation Donnor, de la bourse Delta Kappa Gamma World, du Centre de recherche en reproduction et développement (CRRD), de Hugh E. Burke, Rolande & Marcel Gosselin et de bourses d’études supérieures Alexander McFee.
0.22 µm sterile filter unit | LifeGene | SF0.22PES | |
1 mL syringe | Terumo Medical Corportation | SS-01T | |
1 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P1 | |
3 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P3 | |
30G x 1/2 Needle | BD | 305106 | Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic. |
Adson forceps | Fisher Scientific | 10-000-451 | |
Air-pressured syringe | BD | B302995 | Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B |
Analgesic | – | – | Carprofen, dose: 5mg/kg. |
Antiseptic | Cardinal Health | OMEL0000017 | Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol |
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) – Anesthetic | Sigma Aldrich | T48402-25G | |
Clamp mount micromanipulator | AD Instruments | MM-33 | |
Curved serrated forceps | Fisher Scientific | NC0696845 | |
Dissecting microscope | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B. |
Eye lubricant | Alcon | – | Systane ointment (Lubricant eye ointment) |
Glass capillary needles | Sutter Instrument Co. | B100–50-10 | Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm |
Hartman hemostats | Fisher Scientific | 50-822-711 | |
Heating pad/disc | – | – | SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand. |
Magnetic Mount for micromanipulator | AD Instruments | MB-B | Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection. |
Micro bulldog clamp | Fisher Scientific | 50-822-230 | 3 cm |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70 |
Petri dish | Fisher Scientific | 263991 | Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic Inc. | PD8117 | 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. |
Pulse generator/Electroporator | BEX CO., LTD | CUY21 EDIT II | Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar |
Rosa-LSLtdTomato mice | The Jackson Laboratory | 7914 | Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J |
Sharp-blunt dissection scissors | Fisher Scientific | 28251 | |
Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | SDI130 | |
Shaver | – | – | Hair removal cream can also be used. |
Silk braided sutures | Ethicon | 682G | 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used. |
Tapered ultrafine tip forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Thin absorbent paper | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimwipes |
Trypan blue | STEMCELL Technologies | 7050 | Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection. |