휴대용 Benchtop Focused Ultrasound System을 사용한 마우스 모델의 다형 교모세포종 치료를 위한 Sonodynamic Therapy

모든 동물 연구는 존스 홉킨스 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 따라 승인 및 수행되었습니다. 흉선 누드 암컷 마우스(연령: 10주)는 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조). 마스크, 장갑 및 가운 사용을 포함한 모든 생물 안전 레벨 2 (BSL-2) 규정을 준수했습니다. 1. 종양 이식 및 생물 발광 영상 연구의 초기 단계에서는 이전에 발표된 보고서6에 따라 두개내 종양 이식을 수행한다.참고: 이 연구에서는 4μL의 세포 현탁액에 있는 100,000개의 M59 인간 교모세포종 이종이식 세포를 두개골에 3.0mm 깊이로 이식하는 데 사용했습니다. 치료 전, 이전에 발표된 보고서7에 따라 in vivo 발광 이미징 시스템(재료 표 참조)을 사용하여 각 마우스의 종양 크기를 비침습적으로 정량화한다.참고: 이것은 초기 종양 이식 후 7일 후인 치료 날짜에 수행되었습니다. 이미징 정량화를 사용하여 치료를 위해 마우스를 비교 가능한 하위 그룹으로 나눕니다.참고: 이 연구에서는 (1) 치료되지 않은 종양 보유 마우스(n = 4) 및 (2) SDT를 받는 종양 보유 마우스(n = 4)의 두 하위 그룹이 포함되었습니다. 두 그룹 간에 치료 전 종양 크기에서 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다(p > 0.05). 2. 시술일 설정 냉동실에서 5-ALA 염산염( 재료 표 참조)을 제거하고 5-ALA의 마우스 무게 200mg/kg을 칭량합니다(예: 25g 마우스의 경우 5mg의 무게를 잰다). 주변광에서만 하십시오.알림: 사용하기 전에 모든 장비를 멸균하십시오. 5-ALA의 총량을 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시켜 각 동물에게 올바른 중량량으로 60mg/mL의 5-ALA 용액을 투여합니다(예: 25g 마우스의 경우 5-ALA 5mg을 83.33μL의 PBS에 용해). SDT 테스트 그룹의 각 동물에 대해 적절한 양의 5-ALA 용액을 동물에게 복강 내로 주입합니다(2.1 및 2.2단계에서 계산). 5-ALA를 대사하기 위해 동물을 3시간 동안 케이지에 두십시오. 3. 실험 필수 요건 준비 물통에 탈이온수(DI)를 채웁니다.알림: 필요한 물의 양은 연구에 사용된 마우스 수를 기준으로 합니다. Flow in 및 Flow out 튜브를 초음파 탈기 장치에 부착하고( 재료 표 참조) 탈기 장치를 전원에 연결합니다(1 = ON, 0 = OFF). Flow in 및 Flow out 튜브의 다른 쪽 끝을 DI 물통에 넣습니다. 탈기 장치를 켜고 45분 동안 작동합니다. 새로 가스가 제거된 물을 연구 중에 사용할 밀폐되고 밀봉된 용기 상단에 채웁니다. 초음파 젤( 재료 표 참조)을 원뿔형 튜브에 붓고 원심분리기에 넣고 160 x g 에서 5분 동안 회전하여 겔에서 공기를 제거합니다.알림: 각 동물의 머리에 젤 덩어리를 형성하려면 충분한 젤이 필요합니다. 4. MRgFUS 시스템 설정 그림 1(하단 패널)과 같이 배선도를 사용하여 MRgFUS 시스템(재료 표 참조)을 연결합니다.필요한 모든 구성 요소(데스크톱 컴퓨터, 모니터, MRgFUS 플랫폼, 오실로스코프, 증폭기)를 전원에 연결합니다. 모든 케이블을 올바른 위치에 연결하십시오. BNC 및 동축 케이블을 통해 원하는 변환기를 MRgFUS 플랫폼에 연결한 다음 해당 임피던스 매칭 박스를 올바른 와이어에 연결합니다.참고: 본 연구에는 515kHz 변환기가 사용되었습니다. 모든 장치를 켭니다. 데스크톱 컴퓨터 운영 체제에서 FUS 시스템 소프트웨어에 이미 통합된 AUREUS 응용 프로그램을 엽니다. 모든 하드웨어 연결을 선택하여 하드웨어를 시스템에 연결하고 구성 요소가 소프트웨어와 통신하는지 확인합니다. 드롭다운 메뉴를 선택하고 원하는 변환기를 선택하여 사용되는 변환기를 선택합니다. 5. 초기화 팬텀에서 하단 나사를 풀고 캐비티가 넘칠 때까지 탈이온수 및 탈기된 물을 채운 다음 나사를 다시 교체합니다. 팬텀을 해당 MRI 베드 위치에 삽입한 다음( 그림 2 참조) MRI 베드를 해당 슬롯의 MRI 크래들에 놓습니다. MRI 크래들을 MRI 스캐너의 해당 위치에 놓습니다( 재료 표 참조). 팬텀 MRI 베드가 장애물 없이 MRI 구멍으로 밀어 넣어 팬텀의 고품질 이미지를 얻을 수 있도록 크래들을 조정합니다. 나중에 쉽게 복제할 수 있도록 이 위치를 표시합니다.알림: 이 위치를 찾으면 나머지 치료 동안 위치가 변경되지 않습니다. 따라서 동물 MRI 배치에 적합한 위치인지 확인하지 않으면 전체 등록을 반복해야 합니다. 표 1의 설정을 사용하여 팬텀의 MRI 스캔을 수행합니다. 자석 구멍에서 크래들을 제거하되 스캐너에 올려 놓으십시오. 크래들에서 팬텀이 포함된 MRI 베드를 제거한 다음 하단의 페그를 올바른 슬롯에 밀어 넣어 팬텀이 있는 베드를 MRgFUS 시스템에 놓습니다. 트랜스듀서 암(arm)의 마그네틱 슬롯에 정합 팁을 끼워 팬텀을 향해 아래쪽을 향하도록 합니다( 그림 2 참조). 소프트웨어에서 Select a New Home Position(새 홈 위치 선택)을 선택한 다음 Jog Mode On(조그 모드 켜기 )을 선택하여 안내에 초점을 맞춘 찾기를 시작합니다. 조그 모드를 전환한 후 왼쪽, 오른쪽, 위, 아래, 페이지 위 및 페이지 아래 키를 사용하여 변환기 암을 각각 왼쪽, 오른쪽, 앞, 뒤, 위 및 아래 방향으로 수동으로 움직입니다. 포인터 끝이 팬텀 상단에 있는 십자 패턴의 중간에 닿을 때까지 3차원 모두에서 포인터를 수동으로 조정합니다( 그림 2 참조). 팬텀 MRI 이미지를 컴퓨터에 다운로드하여 선택한 디렉토리의 폴더에 저장한 다음 팬텀 이미지 로드를 선택하여 MRI 이미지를 소프트웨어에 로드합니다. 그러면 축 팬텀 슬라이스가 오른쪽 화면을 채웁니다. 마우스 스크롤 막대를 통해 이러한 조각을 스크롤합니다. 이미지를 길게 클릭한 다음 마우스를 위 또는 아래로 움직여 밝기를 조정합니다.참고: 폴더에 있는 파일 중 압축되지 않은 DICOM 파일이 아닌 파일이 있는 경우 소프트웨어가 해당 파일을 읽고 가져올 수 없으므로 해당 폴더에서 다른 파일을 제거합니다. 각각 세 개의 어두운 구멍이 있는 명확한 원이 있는 팬텀 이미지로 스크롤합니다. 팬텀 중앙을 클릭하면 빨간색 원이 나타납니다. 지름이 같고 팬텀의 둘레와 일직선이 될 때까지 원을 클릭하고 끕니다( 그림 2 참조). 이 위치의 좌표를 ‘홈 위치’라고 합니다. L/R, A/P 및 S/I 설정을 클릭하여 저장합니다. Jog Mode Off(조그 모드 끄기)를 클릭하고 트랜스듀서 암(arm)에서 정합 팁을 제거한 다음 Exit Focus Finding(초점 찾기 종료)을 선택합니다. 홈 위치를 확인하여 초기화 시퀀스를 완료합니다. 6. SDT를 위한 동물 준비 유도 챔버에서 isoflurane-O2 가스 혼합물을 사용하여 마우스를 마취합니다. 마취 유도를 위해 가스 유량을 1.0mL/분으로 설정하고 기화기를 2.0%로 설정하며, 일반적으로 챔버에서 3-5분이 필요합니다(재료 표 참조). 발가락을 꼬집어 적절한 진정제를 투여하는지 동물의 상태를 평가합니다. 각막이 건조해지지 않도록 눈에 안과 연고를 바르십시오.알림: 절차 전반에 걸쳐 마취 깊이를 모니터링하십시오. 꼬리 정맥을 통해 40μL의 가돌리늄 조영제를 마우스에 주입합니다( 재료 표 참조). 두개골 위의 두피를 막고 있는 털은 제모 크림과 전자 면도기를 사용하여 제거합니다. 다음 단계를 사용하여 동물을 MRI 침대에 고정합니다( 그림 3 참조).마취를 위해 MRI 베드(그림 3A)의 입구 튜브를 이소플루란 소스에 연결하고 마취 유도를 위해 가스 유량을 1.0mL/분으로, 기화기를 2.0%로 설정합니다. 마취 흡수를 위해 배출 튜브를 숯 필터 용기에 연결합니다. 그림 3B와 같이 노즈 콘 피스를 슬롯에 넣습니다. 그림과 같이 노즈 콘과 침대 끝에 있는 바이트 바 구멍을 통해 바이트 바를 밀어 넣고 바이트 가드 끝이 MRI 침대의 열린 웰 위에 떠 있습니다. 귀가 정위 귀 바 구멍과 일직선이 되도록 동물을 MRI 침대에 놓고 물린 보호대를 통해 이빨을 잠궈 제자리에 고정합니다. 코뿔을 앞으로 밀어 동물의 위에 오도록 하여 마취를 일정하게 합니다. MRI 침대의 양쪽에 있는 구멍을 통해 이어 바를 밀어 넣고 양쪽 이어 바가 쥐의 외이도에 들어갈 수 있을 때까지 동물의 머리를 들어 올립니다.알림: 동물의 고막이 손상될 수 있으므로 너무 많이 밀지 마십시오. 동물이 편안한 자세를 취하고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 일자 드라이버를 사용하여 MRI 호환 나사를 조여 양쪽 이어 바, 노즈 콘 및 바이트 바를 잠급니다. 이렇게 하면 동물이 제자리에 고정되고 동물이 침대에서 꺼질 때까지 머리가 움직이지 않습니다.알림: 이 단계에 따라 MRI 침대에서 동물의 위치에 방해가 되지 않는지 확인하십시오. 동물이 움직이면 프로토콜이 얼마나 멀리 떨어져 있는지에 관계없이 전체 설정(6.5단계)을 반복해야 합니다. 동물이 기다리는 동안 MRI 침대를 따뜻한 열 패드 위에 올려 체온을 유지합니다.알림: 시술 내내 체온을 모니터링하고 유지하십시오. 이소플루란은 플랫폼에 제공된 고정 장치를 사용하여 동물 침대가 FUS 시스템에 고정될 때 치료 전반에 걸쳐 코에 부착된 튜브를 통해 동물에게 지속적으로 공급됩니다. 7. MRI 절차 그림 3과 같이 동물이 정위적으로 고정된 상태에서 MRI 침대를 MRI 받침대 끝에 있는 MRI 침대 구멍을 MRI 받침대의 못에 끼워 넣어 이전에 MRI 스캐너에 연결된 MRI 요람에 놓습니다(재료 표 참조). 입구 및 출구 마취 튜브를 MRI 기계의 해당 튜브에 부착합니다. 동물이 들어 있는 MRI 거치대를 MRI 구멍에 밀어 넣고 팬텀이 놓인 위치와 동일한 위치를 유지하도록 합니다. 위치 파악을 수행하여 동물의 뇌 위치를 확인한 다음 표 2의 MRI 설정을 사용하여 전체 뇌를 포괄하는 조영제 T1 가중 MRI 스캔을 수행합니다. MRI 스캔을 각 슬라이스에 대해 하나씩 압축되지 않은 DICOM 파일 집합으로 내보냅니다. 8. 집속 초음파 치료(그림 4) 스캔이 완료된 후 MRI 요람에서 동물을 꺼내 침대 앞쪽을 플랫폼 뒤쪽의 해당 못에 끼우고 침대 뒷면을 해당 못에 끼워 플랫폼에 놓습니다. 마취를 위해 MRI 베드의 입구 튜브를 이소플루란 소스에 연결하고 마취 유지를 위해 가스 유량을 1.0mL/min으로, 기화기를 2.0%로 설정합니다. 마취 흡수를 위해 배출 튜브를 숯 필터 용기에 연결합니다. DICOM 파일 세트를 컴퓨터로 전송하고 현재 스터디의 기본 작업 디렉토리에 있는 폴더에 배치합니다.참고: 파일 요구 사항은 5.9단계를 참조하십시오. 소프트웨어에서 기본 초기화 페이지로 이동하여 Guided Focus Finding을 클릭하여 Jog Mode를 켠 다음 Jog Mode On을 클릭합니다. 원심분리된 초음파 젤을 동물의 머리에 살짝 바르고 두개골 위의 두피 전체를 덮을 만큼 충분한 젤을 바릅니다. DI 및 탈기된 물을 수조에 최대 80%까지 붓고 수조를 플랫폼의 해당 기둥에 끼웁니다. 바닥 막이 동물의 머리에 있는 초음파 젤에 닿을 때까지 DI 물로 채워진 수조를 내려 물과 젤 사이의 결합 표면을 형성합니다. 초음파 젤이 수조에 대한 동물의 머리 전체를 덮고 수조와 쥐의 두피 사이의 초음파 젤에 기포가 없는지 확인하십시오. 초음파 변환기를 수조에 담그고 변환기 표면에 기포가 형성되지 않도록 합니다. 부분적으로 잠긴 트랜스듀서 쪽으로 조그 모드 다운 을 사용하여 트랜스듀서 암을 내리고 트랜스듀서 표면이 잠긴 상태에서 마그네틱 슬롯을 서로 정렬하여 트랜스듀서에 연결합니다. Jog Mode(조그 모드)를 끈 다음 초기화 단계에서 수행한 대로 Exit Focused Finding(집중 찾기 종료)을 수행합니다. 이전과 같이 홈 위치를 확인하십시오. 치료 탭으로 이동한 다음 화면 상단 중앙에 있는 폴더 아이콘을 클릭하여 조영제 후 T1 가중 MRI 파일을 업로드합니다. 이전에 컴퓨터에 업로드된 DICOM 파일이 포함된 폴더를 선택하고 엽니다. 이 단계는 오른쪽 상단 패널에 있는 모든 DICOM 파일을 자동으로 로드해야 합니다. 그런 다음 초음파 처리 모드 탭에서 버스트 또는 연속 파를 선택하여 적절한 치료 모드를 선택합니다. 버스트 모드인 경우 Sonication Settings(초음파 처리 ) 탭에서 버스트 길이, 버스트 기간 및 기간 수를 입력합니다. 이 매개 변수는 각 초음파 처리 위치에 해당합니다. 연속 웨이브 모드인 경우 초음파 처리 지속 시간만 입력합니다.참고: 이 연구에서는 연속파 모드를 120초 동안 사용했습니다. 페이지 상단 중앙에 있는 대상 아이콘을 클릭하고 FUS 초점 영역을 조준할 올바른 MRI 슬라이스의 적절한 위치를 선택합니다. 클릭한 위치에 빨간색 원이 있는 밝은 빨간색 사각형이 표시됩니다. 하나 이상의 항목을 선택할 수 있습니다. MRI 이미지의 왼쪽에는 선택한 초점 영역의 3D 좌표로 채워지는 테이블이 있습니다. 표의 마지막 열에는 원하는 압력 또는 강도 수준을 얻는 데 사용되는 각 변환기에 대해 별도로 계산할 수 있는 각 초점에서 초음파 처리할 전력 수준을 입력합니다. 표의 각 초점을 클릭하여 확인하면 좌표가 강조 표시되고 이미지의 해당 초점 영역이 파란색으로 바뀝니다.알림: 변환기 데이터시트를 참조하여 표에 입력된 전력 수준을 압력 또는 강도로 변환하는 방법을 결정하십시오. 모든 초점 영역이 만족스러우면 모션 테스트를 선택합니다. 이렇게 하면 소프트웨어가 변환기를 모든 초점으로 이동하여 이동이 가능한지 확인하라는 메시지가 표시됩니다. 확인 후 소프트웨어에 모션 테스트 완료가 표시됩니다. 오류가 발생하면 초점 영역이 변환기 모터의 3D 축에 맞도록 조정합니다. 준비가 되면 초음파 처리 시작 을 선택하여 초음파 처리 프로토콜을 시작하고 변환기를 이동하고 선택한 각 초점 영역에 올바른 FUS 매개 변수를 적용합니다. 초음파 처리 프로토콜이 완료되면 변환기 암에서 변환기를 분리하고 플랫폼에서 수조를 제거한 다음 동물의 두피에서 초음파 젤을 닦아냅니다. 물린 부분과 이어 바의 나사를 풀고 MRI 침대에서 동물을 꺼낸 다음 동물이 마취에서 깨어날 때까지 따뜻한 패드 위에 동물을 놓습니다. 이 시점에서 동물을 케이지로 되돌려 보냅니다. 후속 동물의 경우 섹션 6부터 시작하여 동일한 프로토콜을 반복합니다. 원하는 동물을 치료한 후에는 동물이 만지는 모든 표면을 70% 에탄올로 청소하십시오( 재료 표 참조). 소프트웨어를 종료한 다음 각 장비를 종료하고 끕니다. 9. 치료 후 단계 처리 후 24시간 측정하는 생물 발광에 대해 섹션 1의 IVIS(in vivo imaging system) 프로토콜을 반복합니다. 치료 효과를 분석하려면 치료 전과 후의 생물 발광 기록을 비교하여 치료군과 치료하지 않은 군 모두의 성장률을 결정합니다. 6.4단계와 동일한 설정을 사용하여 후속 MRI 스캔을 수행합니다. 조영제 강화 스캔을 사용하여 종양 영역의 평균 그레이스케일 강도를 비교하거나 조영제가 커버하는 총 부피를 계산하여 치료 전후 종양 부피의 차이를 확인합니다.