使用便携式台式聚焦超声系统治疗小鼠模型中多形性胶质母细胞瘤的声动力疗法

所有动物研究均根据约翰霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准和进行。无胸腺裸雌性小鼠（年龄：10周）是从商业来源获得的（见 材料表）。遵守所有生物安全 2 级 （BSL-2） 规定，包括使用口罩、手套和防护服。 1. 肿瘤植入和生物发光成像 在研究的初始阶段，按照先前发表的报告进行颅内肿瘤植入6.注：在这项研究中，使用 4 μL 细胞悬液中的 100,000 个 M59 人 GBM 异种移植细胞以 3.0 mm 的深度植入颅骨。 在治疗之前，按照先前发表的报告7，使用体内发光成像系统（参见材料表）无创地量化每只小鼠的肿瘤大小。注意：这是在治疗之日完成的，即初始肿瘤植入后 7 天。 使用成像定量，将小鼠分成可比的亚组进行治疗。注：在这项研究中，包括两个亚组：（1） 未经治疗的荷瘤小鼠 （n = 4） 和 （2） 接受 SDT 的荷瘤小鼠 （n = 4）。两组治疗前肿瘤大小差异无统计学意义（p > 0.05）。 2. 治疗日设置 从冰箱中取出5-ALA盐酸盐（参见 材料表），称出200mg / kg小鼠重量的5-ALA（例如，对于25g小鼠，称出5mg）。仅在环境光下进行。注意： 使用前对所有设备进行无菌处理。 将5-ALA的总量溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，使得每只动物以正确的重量剂量施用60mg / mL的5-ALA溶液（例如，对于25g小鼠，将5mg 5-ALA溶解到83.33μL的PBS中）。 对于SDT试验组中的每只动物，腹膜内向动物注射适量的5-ALA溶液（按步骤2.1和2.2计算）。 将动物留在笼子中3小时以代谢5-ALA。 3. 准备实验所需的条件 用去离子 （DI） 水填充水箱。注意：所需的水量取决于研究中使用的小鼠数量。 将流 入 管和 流出 管连接到超声波脱气机（参见 材料表）并将脱气机插入电源（1 = ON，0 = OFF）。 将流 入 管和 流出 管的另一端放入 DI 储水器中。 打开脱气机并运行 45 分钟。 将新脱气的水填充到密封容器的顶部，以便在研究期间使用。 将超声凝胶（参见 材料表）倒入锥形管中，然后放入离心机中以160× g 旋转5分钟以除去凝胶中的任何空气。注意：需要足够的凝胶才能在每只动物的头部形成一团凝胶。 4. MRgFUS系统设置 使用图 1（底面板）所示的接线图连接 MRgFUS 系统（参见材料表）。将所有必要的组件（台式计算机、显示器、MRgFUS 平台、示波器、放大器）连接到电源。 将所有电缆连接到正确的位置。 通过BNC和同轴电缆将所需的换能器连接到MRgFUS平台，然后将相应的阻抗匹配盒连接到正确的电线上。注：本研究使用 515 kHz 换能器。 打开所有设备。 在台式计算机操作系统上，打开 AUREUS 应用程序，该应用程序已集成到 FUS 系统软件中。 选择 “连接所有 硬件”将硬件连接到系统，并确保组件与软件通信。 通过选择下拉菜单并选择所需的换能器来选择使用的换能器。 5. 初始化 从幻影上拧下底部螺钉，用去离子和脱气水填充腔体，直到溢出，然后再次更换螺钉。 将模型插入其相应的 MRI 床位置（见 图 2），然后将 MRI 床放入相应插槽中的 MRI 支架中。 将 MRI 支架放在 MRI 扫描仪中的相应位置（参见 材料表）。调整支架，使幻影 MRI 床可以毫无障碍地滑入 MRI 孔中，以获得幻影的高质量图像。标记此位置，以便将来易于复制。注意：一旦找到这个位置，在剩余的治疗过程中，该位置将不会改变。因此，请确保它是放置动物 MRI 的适当位置，否则需要重复整个注册。 使用 表 1 中的设置对模型进行 MRI 扫描。 从磁铁孔中取出支架，但将其放在扫描仪上。从支架上取下包含模型的 MRI 床，然后将带有模型的床滑入正确的插槽，将装有模型的床放在 MRgFUS 系统上。 将定位尖端插入换能器臂上的磁槽上，使其向下指向幻象（见 图 2）。 在软件上，选择“ 选择新的起始位置”，然后选择“ 点动模式开启 ”以开始引导式聚焦查找。切换点动模式后，使用左、右、上、下、向上翻页和向下翻页键分别手动移动换能器臂在左、右、前、后、上、下方向。 在所有三个维度上手动调整指针，直到指针的尖端接触位于幻影顶部的十字图案的中间（参见 图 2）。 将 Phantom MRI 图像下载到计算机并将它们放在所选目录的文件夹中，然后通过选择 加载 Phantom Images 将 MRI 图像加载到软件中。然后，轴向幻影切片将填充右侧的屏幕。 通过 鼠标滚动条滚动浏览这些切片。通过单击并按住图像，然后向上或向下移动鼠标来调整亮度。注意：如果文件夹中的任何文件不是未压缩的 DICOM 文件，则软件将无法读取和导入它们，因此请从该文件夹中删除任何其他文件。 滚动到幻影的任何图像，其中有一个清晰的圆圈，每个圆圈中有三个黑洞。点击幻影的中间，会弹出一个红色的圆圈。单击并拖动圆圈，直到其直径相同并与模型的周长对齐（参见 图 2）。 该位置的坐标称为“初始位置”;通过单击 “设置 L/R”、“A/P”和“S/I”来保存此内容。 单击“ 点动模式关闭”，从换能器臂上取下定位提示，然后选择 “退出对焦查找”。确认初始位置以完成初始化序列。 6. 特殊和差别待遇的动物准备 在诱导室中使用异氟烷-O2气体混合物麻醉小鼠。将气体流速设置为 1.0 mL/min，将汽化器设置为 2.0% 以进行麻醉诱导，通常需要在腔室中 3-5 分钟（参见材料表）。 通过捏脚趾来评估动物是否有足够的镇静作用。在眼睛上涂抹眼药膏，以避免角膜干燥。注意： 在整个手术过程中监测麻醉深度。 通过尾静脉向小鼠注射40μL钆造影剂（参见 材料表）。 使用脱毛膏和电子剃须刀去除头骨上方任何阻碍头皮的毛发。 使用以下步骤将动物固定在MRI床上（见 图3）。将MRI床的入口管（图3A）连接到用于麻醉的异氟醚源，并将气体流速设置为1.0mL / min，将蒸发器设置为2.0%以进行麻醉诱导。将出口管连接到木炭过滤罐以进行麻醉吸收。 将鼻锥片放入其插槽中， 如图 3B 所示。如图所示，将咬杆滑过鼻锥和床末端的咬杆孔，咬合保护端悬停在MRI床的开口孔上。 将动物放在MRI床上，其耳朵与立体定向耳杆孔对齐，并通过咬合护罩将其牙齿锁定以将其固定到位。将鼻锥向前滑动，使其位于动物鼻子的顶部，以提供稳定的麻醉流。 将耳杆滑过MRI床两侧的孔，抬起动物的头部，直到两个耳杆都可以放入小鼠的耳道。注意： 不要用力过猛，因为这会损坏动物的耳膜。 确保动物处于舒适的位置。然后，使用一字螺丝刀拧入与 MRI 兼容的螺钉，以锁定两个耳杆、鼻锥和咬杆。这会将动物锁定到位并防止任何头部移动，直到动物从床上移开。注意：在此步骤之后，确保动物在MRI床上的位置没有受到干扰。如果动物移动，则无论协议有多远，都需要重复整个设置（步骤6.5）。 在动物等待时，将MRI床放在温暖的加热垫上以保持体温。注意：在整个过程中监测和保持体温。 当动物床固定在FUS系统上时，使用平台上提供的固定装置，在整个治疗过程中，异氟醚通过连接到鼻锥 的管子 连续供应给动物。 7. 核磁共振成像程序 将MRI床与动物立体定向固定，并将其放置在先前连接到MRI扫描仪的MRI支架中（参见 材料表），方法是将MRI床孔末端的钉子插入MRI支架上的钉子， 如图3所示。将入口和出口麻醉管连接到MRI机器中的相应管子上。 将包含动物的 MRI 支架滑入 MRI 孔中，确保保持与模型放置位置相同的位置。 执行定位器以查看动物大脑的位置，然后使用表 2 中的 MRI 设置进行覆盖整个大脑的造影剂后 T1 加权 MRI 扫描。 将 MRI 扫描导出为一组未压缩的 DICOM 文件，每个切片一个。 8. 聚焦超声治疗（图4） 扫描完成后，将动物从MRI支架中取出，并将其放置在平台上，方法是将床的前部插入平台后部的相应钉子中，然后将床的后部插入相应的钉子中。 将MRI床的入口管连接到异氟醚源进行麻醉，并将气体流速设置为1.0 mL / min，将汽化器设置为2.0%以维持麻醉。将出口管连接到木炭过滤罐以进行麻醉吸收。 将 DICOM 文件集传输到计算机，并将它们放在当前算例主工作目录中的文件夹中。注意：有关文件要求，请参阅步骤 5.9。 在软件中，进入主初始化页面，点击引导式对焦开启开启点动模式，再点击点动模式开启。 将少量离心超声凝胶放在动物的头部，其凝胶足以覆盖头骨上方的整个头皮。 将去离子水和脱气水倒入水浴中，最高可达80%，然后将水浴槽槽到平台上相应的色谱柱上。 降低装满去离子水的水浴，直到底膜接触动物头部的超声波凝胶，在水和凝胶之间形成耦合表面。确保超声波凝胶覆盖到水浴的整个动物头部，并且水浴和小鼠头皮之间的超声波凝胶中没有气泡。 将超声波换能器浸入水浴中，确保换能器表面没有形成气泡。 使用 点动模式将 换能器臂降低到部分浸没的换能器，并在换能器表面保持浸没的情况下，通过将磁槽相互对齐，将其耦合到换能器上。 关闭“ 点动模式”，然后 退出“聚焦查找”，就像在初始化步骤中所做的那样。确保像以前一样确认原点位置。 转到“治疗”选项卡，然后通过单击屏幕顶部中间的文件夹图标上传造影剂后 T1 加权 MRI 文件。选择包含之前上载到计算机的 DICOM 文件的文件夹并打开它们。此步骤应自动加载右上角面板中的所有 DICOM 文件。 接下来，在“ 超声处理 模式”选项卡中，通过选择 “突发 ”或“ 连续波”来选择适当的治疗模式。如果处于突发模式，请在超 声处理设置 选项卡中输入突发长度、突发周期和周期数。这些参数将对应于每个超声处理位置。如果处于连续波模式，则仅输入超声处理持续时间。注：在本研究中，连续波模式的持续时间为 120 秒。 单击页面顶部中间的目标图标，然后在正确的 MRI 切片上选择要瞄准 FUS 焦点区域的正确位置。单击的地方会出现一个带有红色圆圈的浅红色方块。可以选择多个选项。 MRI 图像的左侧是一张表格，其中将填充所选焦点区域的 3D 坐标。在表格的最后一列中，输入每个焦点处要超声处理的功率水平，可以针对用于获得所需压力或强度水平的每个传感器单独计算。单击表格中的每个焦点进行确认，这将导致坐标被突出显示，并且图像上相应的焦点区域将变为蓝色。注意： 请参阅传感器数据表以确定如何将输入到表中的功率水平转换为压力或强度，因为这些值是特定于传感器的。 对所有焦点区域都感到满意后，选择 运动测试。这将促使软件将换能器移动到所有焦点，以确保移动是可能的。确认后，软件将指示 运动测试完成。如果发生错误，请调整焦点区域，使其适合换能器电机的 3D 轴。 准备就绪后，选择“开始超声处理”以 开始超声处理 方案，移动换能器并在选定的每个焦点区域应用正确的 FUS 参数。 超声处理方案完成后，将换能器与换能器臂分离，从平台上取下水浴，然后擦去动物头皮上的超声凝胶。 拧下咬杆和耳杆，将动物从MRI床上移开，然后将动物放在温暖的垫子上，直到动物从麻醉中醒来。此时，将动物放回笼子。 对于随后的动物，从第6节开始重复相同的方案。 处理所需动物后，用70%乙醇清洁动物接触的所有表面（参见 材料表）。 退出软件，然后关闭并关闭每台设备。 9. 后处理步骤 重复第1节中的 体内 成像系统（IVIS）方案，用于治疗后24小时测量的生物发光。为了分析治疗效果，比较治疗前后的生物发光记录，以确定治疗组和未治疗组的生长速率。 使用与步骤 6.4 相同的设置进行后续 MRI 扫描。使用造影剂增强扫描，比较肿瘤区域的平均灰度强度或计算造影剂覆盖的总体积，以确定治疗前后肿瘤体积的差异。