La rottura della barriera emato-spinale (BSCB) può essere ottenuta con successo con la somministrazione endovenosa di microbolle e l’applicazione di ultrasuoni focalizzati a bassa intensità (LIFU). Questo protocollo descrive in dettaglio l’apertura del BSCB utilizzando LIFU in un modello di roditore, inclusa la configurazione dell’apparecchiatura, l’iniezione di microbolle, la localizzazione del bersaglio e la visualizzazione dell’interruzione del BSCB.
Gli ultrasuoni focalizzati a bassa intensità (LIFU) utilizzano pulsazioni ultrasoniche a intensità inferiori rispetto agli ultrasuoni e vengono testati come tecnologia neuromodulatoria reversibile e precisa. Sebbene l’apertura della barriera emato-encefalica (BBB) mediata da LIFU sia stata esplorata in dettaglio, ad oggi non è stata stabilita alcuna tecnica standardizzata per l’apertura della barriera emato-spinale (BSCB). Pertanto, questo protocollo presenta un metodo per l’interruzione di successo di BSCB utilizzando la sonicazione LIFU in un modello di ratto, comprese le descrizioni della preparazione animale, la somministrazione di microbolle, la selezione e la localizzazione del bersaglio, nonché la visualizzazione e la conferma dell’interruzione di BSCB. L’approccio qui riportato è particolarmente utile per i ricercatori che hanno bisogno di un metodo rapido ed economico per testare e confermare la localizzazione del bersaglio e la precisa interruzione del BSCB in un modello animale di piccola taglia con un trasduttore a ultrasuoni focalizzato, valutare l’efficacia del BSCB dei parametri di sonicazione o esplorare le applicazioni per la LIFU nel midollo spinale, come la somministrazione di farmaci. immunomodulazione e neuromodulazione. Si raccomanda di ottimizzare questo protocollo per l’uso individuale, in particolare per far progredire il futuro lavoro preclinico, clinico e traslazionale.
Simile alla barriera emato-encefalica (BBB), la barriera emato-midollare (BSCB) regola il movimento dei soluti, delle cellule e dei componenti plasmatici circolanti nel parenchima spinale1. Questa caratteristica protettiva è il risultato di un sistema specializzato di cellule endoteliali strettamente legate e non fenestrate che rivestono i capillari spinali2. Tipicamente, solo le molecole lipofile a basso peso con una carica positiva possono attraversare entrambe le barriere3. Nonostante gli studi suggeriscano che il BSCB abbia una permeabilità leggermente superiore rispetto al BBB, entrambe le barriere limitano la somministrazione di terapie al sistema nervoso centrale4. Sono state sviluppate diverse strategie per aumentare il trasporto di farmaci attraverso il BSCB, tra cui tecniche per aumentare la pressione osmotica nei capillari spinali, lo sviluppo di farmaci che interagiscono con i recettori della bradichinina e la creazione di nanoparticelle funzionalizzate5.
L’interruzione del BSCB può essere ottenuta anche tramite la somministrazione endovenosa di microbolle (MB) seguita da sonicazione a ultrasuoni focalizzati a bassa intensità (LIFU)6. Il campo acustico generato dal trasduttore a ultrasuoni provoca oscillazioni MB, che a loro volta esercitano sollecitazioni contro la parete endoteliale e allentano le giunzioni strette7. L’allentamento della giunzione stretta crea spazi vuoti transitori nei capillari, consentendo alle terapie di penetrare nel parenchima spinale (Figura 1). Questo processo può anche creare fenestrazioni transendoteliali, aumentare la transcitosi e sottoregolare i trasportatori a cassetta leganti l’ATP, come la glicoproteinaP 8,9. Un vantaggio chiave di questa tecnica è la capacità di ridurre al minimo gli effetti fuori bersaglio dirigendo la regione focale della sonicazione verso la posizione di interesse nel midollo spinale. Diversi studi clinici hanno studiato l’efficacia dell’apertura della BBB mediata da LIFU per il trattamento delle patologie del sistema nervoso centrale, tra cui gliomi, sclerosi laterale amiotrofica, morbo di Alzheimer e morbo di Parkinson. Sebbene l’interruzione della BSCB mediata da LIFU non sia così ampiamente caratterizzata come la rottura della BBB mediata dalla LIFU, diversi gruppi hanno riportato un’interruzione della BSCB di successo nei modelli di roditori, conigli e suini10,11,12. Nel complesso, l’interesse per la tecnica è in rapida crescita, soprattutto come strada percorribile per la somministrazione di farmaci.
In questo protocollo, viene descritta una tecnica per l’interruzione di BSCB mediata da LIFU in un modello di ratto. La procedura include descrizioni dettagliate della preparazione dell’animale, della configurazione dell’apparecchiatura LIFU, della somministrazione di MB, della localizzazione del bersaglio e dell’estrazione del midollo spinale. La conferma della localizzazione del bersaglio e dell’interruzione del BSCB viene valutata tramite lo stravaso del colorante blu Evans (EBD) nel midollo spinale. L’EBD è un composto non tossico che si lega all’albumina sierica e può essere identificato visivamente dal suo ricco colore blu e dall’autofluorescenza rossa al microscopio13.
I passaggi qui elencati offrono un’alternativa rapida ed economica ai tradizionali sistemi LIFU guidati da ultrasuoni (US) o risonanza magnetica (RM). Di conseguenza, questo metodo è utile per i ricercatori interessati a testare e confermare rapidamente le capacità di targeting e di interruzione del BSCB del loro trasduttore LIFU prima di acquisire apparecchiature e materiali aggiuntivi o perseguire applicazioni LIFU al midollo spinale, come la somministrazione di farmaci, l’immunomodulazione e la neuromodulazione.
Qui, vengono descritte le apparecchiature e le fasi necessarie per un’interruzione efficace e mirata del BSCB utilizzando ultrasuoni focalizzati a bassa intensità (LIFU) combinati con la somministrazione di microbolle (MB). Questo protocollo è flessibile e può essere ottimizzato per l’uso individuale con trasduttori di diverse specifiche. Altre tecniche per l’interruzione del BSCB mediata da LIFU si basano sull’uso di sistemi guidati dalla risonanza magnetica (MRI) per la localizzazione del bersaglio, che è una risorsa costosa16. I vantaggi della tecnica qui presentata risiedono nella rapida conferma visiva in tempo reale dell’interruzione del BSCB e nella facilità di targeting grazie alla natura aperta della procedura. Inoltre, l’apparato laser è semplice da usare e da costruire, e un file CAD è incluso nella sezione supplementare. Di conseguenza, i ricercatori interessati a condurre test iniziali sulle capacità di targeting del loro trasduttore LIFU in un modello animale di piccole dimensioni possono utilizzare questo protocollo come strumento per confermare rapidamente il posizionamento della zona focale su una posizione di interesse. Questa tecnica può essere utilizzata anche dai laboratori che iniziano a studiare le applicazioni cliniche della LIFU, come la somministrazione di farmaci, prima di investire in modalità di guida più complesse come i sistemi ecografici o RM. Attualmente, le modalità ecoguidate presentano un percorso più promettente ed economico rispetto ai sistemi RM, sebbene questi ultimi siano più frequentemente osservati in letteratura.
Ci sono diversi passaggi critici in questa procedura che devono essere eseguiti con attenzione per garantire il successo dell’interruzione del BSCB. È imperativo evitare di esercitare una pressione non necessaria sul midollo spinale durante la laminectomia chirurgica. Un’eccessiva manipolazione fisica del cavo aumenta la probabilità di danni al BSCB. Il danno appare come una macchia marrone scuro all’interno del cordone dopo l’estrazione a causa dell’emorragia e dell’aumento dello stravaso di EBD. Inoltre, deve essere assicurato il massimo accoppiamento tra il trasduttore e il midollo spinale esposto. Di conseguenza, è necessario prestare attenzione a rimuovere le bolle dal cono d’acqua e dal gel per ultrasuoni. Non devono esserci spazi vuoti tra il fondo del cono d’acqua e il cavo per garantire la piena trasmissione dell’onda acustica. Durante il cateterismo della vena caudale, si dovrebbe evitare di far passare accidentalmente l’aria insieme alle soluzioni saline eparinizzate, EBD o MB. L’iniezione di aria aumenta notevolmente la possibilità di un’embolia polmonare che provoca la morte del roditore prima della conclusione della procedura28.
Un problema comune che può essere riscontrato durante questa procedura è il fallimento dell’iniezione EBD. Per le persone con esperienza minima nel cateterismo della vena caudale, l’esecuzione di questo passaggio prima della laminectomia, del posizionamento o del targeting degli animali farà risparmiare tempo. L’EBD può anche essere iniettato ben prima dell’iniezione di MB senza influenzare la sonicazione. L’utilizzo del laccio emostatico e del bagno di acqua calda suggeriti in questo protocollo aiuterà a dilatare le vene caudali e ad aumentare il tasso di successo. Inoltre, la disidratazione dei ratti riduce la probabilità di un corretto posizionamento del catetere. Può essere utile un’iniezione salina intraperitoneale 10-15 minuti prima del cateterismo della vena caudale. Durante il cateterismo, si dovrebbe iniziare 2 in sopra l’estremità della coda e muoversi in direzione caudale verso il cranio. Muoversi nella direzione opposta diminuisce la probabilità di successo a causa di un potenziale collasso o emorragia venosa.
Un’altra sfida comune riguarda la mancanza di stravaso EBD nonostante la sonicazione. Ciò può indicare che i parametri utilizzati per la sonicazione sono insufficienti per l’interruzione del BSCB. Ad esempio, se la frequenza di sonicazione è impostata su un valore che differisce notevolmente dalla frequenza centrale del trasduttore, la potenza di sonicazione sarà troppo bassa per oscillare MB e causare l’allentamento della giunzione stretta. Inoltre, maggiore è il numero di interfacce tra il trasduttore e il cavo (ad esempio, cono d’acqua, membrana, gel, bolle d’aria in acqua/gel), minore sarà la vera intensità di sonicazione sul bersaglio. Ridurre al minimo queste interfacce, ad esempio utilizzando gel degassizzato e rimuovendo accuratamente le bolle all’interno del cono, aiuterà a trasmettere il pieno potenziale della sonicazione. Il protocollo incoraggia anche ad aumentare il tempo tra la sonicazione e la perfusione per consentire più tempo per lo stravaso di EBD nel parenchima spinale. Sebbene l’interruzione del BSCB sia una procedura transitoria, gli spazi vuoti sono presenti per diverse ore prima della chiusura. Un lungo tempo di attesa aumenta l’esposizione all’isoflurano, ma provoca anche un maggiore stravaso di EBD nel cordone ombelicale. In alternativa, può essere presente uno stravaso di EBD nonostante l’assenza di sonicazione con LIFU. Per risolvere questo problema, è necessario prestare attenzione durante la laminectomia per evitare danni accidentali al BSCB. Le possibili soluzioni includono il sollevamento della colonna vertebrale del ratto durante il clampaggio per aumentare la quantità di spazio tra le lamine e il cordone, nonché una laminectomia più breve. Un’accurata perfusione di PFA riduce anche la colorazione di fondo rimuovendo il sangue arricchito di EBD dalla vascolarizzazione all’interno del midollo spinale. Durante la perfusione transcardica, è necessario prestare attenzione per prevenire la rottura accidentale del cuore, che può provocare la fuoriuscita di PBS o PFA.
È importante notare che questo studio rappresenta un’esperienza a centro singolo per l’interruzione della BSCB mediata da LIFU. Inoltre, questo protocollo non testa o ottimizza vari parametri di energia di sonicazione e concentrazioni di MB. Di conseguenza, i ricercatori sono incoraggiati a studiare vari parametri e concentrazioni durante l’esecuzione di questa tecnica per ottimizzare la localizzazione del bersaglio e l’interruzione del BSCB per le loro particolari esigenze di ricerca, soprattutto se i risultati iniziali producono effetti avversi. I gruppi che desiderano non vedere cambiamenti di temperatura, ad esempio, possono testare vari parametri fino a trovare un set che soddisfi questo criterio e raggiunga una sufficiente interruzione del BSCB. Inoltre, possono essere condotti ulteriori esperimenti per confermare la sicurezza di questa tecnica. Ad esempio, è possibile aumentare le dimensioni del campione, estendere il periodo di sopravvivenza e condurre studi di elettromiografia/analisi del cammino. Per una sopravvivenza più lunga, è importante tenere presente che alcuni studi dimostrano che alte dosi di EBD possono talvolta causare tossicità sistemica cronica, quindi una dose più bassa può essere prudente29.
Un’altra limitazione di questa procedura è la natura invasiva della laminectomia (che è necessaria per qualsiasi tecnica che utilizzi LIFU per l’apertura del BSCB poiché gli ultrasuoni non possono penetrare attraverso l’osso). La natura invasiva di questa procedura può essere ridotta limitando la durata della laminectomia. L’esecuzione della laminectomia nelle vertebre toraciche superiori, che sono più corte e sottili, può ridurre il tempo necessario per la laminectomia al di sotto dei 10 minuti. A causa della natura fragile dei MB, nonché della loro breve emivita, il tempo è limitato durante questo protocollo. L’iniezione di MB deve avvenire 1-2 minuti prima del trattamento con LIFU e i nuovi MB devono essere somministrati prima di ogni sonicazione se vengono eseguiti più trattamenti LIFU. Per gli esperimenti che prevedono l’interruzione di BSCB per più ratti, potrebbe essere necessario preparare diverse fiale MB. Poiché le microbolle sono costose, è preferibile modificare il flusso di lavoro chirurgico per ridurre al minimo il tempo tra le sonicazioni per risparmiare il numero di MB utilizzati.
La tecnica qui descritta è principalmente da utilizzare come protocollo di ricerca. Sebbene l’apparato di puntamento laser non sostituirà le modalità di puntamento tradizionali in tutti i contesti clinici, può essere utile in altre situazioni. Per gli interventi chirurgici non invasivi, le modalità di risonanza magnetica tradizionali possono essere utilizzate in modo affidabile per il targetingdi 30. Per gli interventi chirurgici invasivi che includono l’esecuzione di una laminectomia, l’apparato laser descritto in questo protocollo può essere utilizzato per localizzare rapidamente il centro della zona focale di sonicazione su una regione specifica (ad esempio, un tumore o un sito di lesione del midollo spinale) ai fini della somministrazione di farmaci o della terapia immunomodulatoria, integrando qualsiasi guida RM che avrebbe luogo.
Nel complesso, questo protocollo descrive una tecnica efficace e di successo per l’interruzione del BSCB e include diverse opzioni per la conferma dell’apertura del BSCB, sia in tempo reale che in post-elaborazione. Poiché il BSCB funge da barriera all’ingresso nel parenchima del midollo spinale, l’interruzione del BSCB è un possibile metodo per migliorare la somministrazione di terapie. Ad esempio, Weber-Adrian et al. hanno utilizzato LIFU con una frequenza di 1,114 MHz e una lunghezza di burst di 10 ms per mediare la consegna genica al rachide cervicale6. Allo stesso modo, Smith et al. hanno dimostrato che la LIFU con una frequenza di 580 kHz, pressioni di picco acustiche medie intorno a 0,46 MPa e una lunghezza di burst di 10 ms potrebbe aiutare nella somministrazione di un anticorpo monoclonale, trastuzumab, al midollo spinale in un modello di roditore di metastasi leptomeningee10. La maggior parte degli studi si è concentrata sull’utilizzo di LIFU, piuttosto che HIFU, a causa della capacità di LIFU di permeabilizzare transitoriamente il BSCB evitando danni al tessuto sottostante. In genere, la LIFU utilizza intensità comprese tra 0,125-3 W/cm 2, mentre la HIFU utilizza intensità comprese tra 100 e 10.000 W/cm2 o superiori31. Di conseguenza, l’HIFU esercita i suoi effetti principalmente attraverso il riscaldamento dei tessuti, mentre la LIFU, con la co-somministrazione di MB, agisce attraverso effetti di cavitazione meccanica. La co-somministrazione di terapie con MB può comportare un maggiore stravaso del farmaco nel parenchima spinale, nonché la possibilità di caricare MB con il farmaco e lisare i MB con ultrasuoni per la somministrazione mirata del farmaco.
I parametri di sonicazione, la concentrazione di MB e il tipo di trasduttore utilizzato in questo studio possono essere modificati in base alle esigenze sperimentali. Ad esempio, un trasduttore con una regione focale più piccola può essere preferibile per esperimenti in cui è necessario un maggiore controllo sul targeting localizzato, mentre un trasduttore con una potenza maggiore può essere utilizzato per esperimenti che richiedono una potente interruzione in un lasso di tempo più breve. Grazie alla flessibilità offerta da questo protocollo, esiste un grande potenziale per l’uso nella ricerca preclinica, clinica e traslazionale.
The authors have nothing to disclose.
Con il sostegno di T32GM136577 (D.R.); N660012024075 (N.T., N.V.T., A.M., K.K.L.); R01 HL139158-01A1 e R01 HL071568-15 (N.V.T.); Programma di studiosi di ricerca clinica ICTR della Johns Hopkins (KL2) (A.M.). Diverse figure create con BioRender.com.
0.9% Heparinized Sodium Chloride | Baxter | FKB0953G | Flush tail vein catheter with heparinized saline to prevent clotting. |
100 mL Luer Lock Tip Syringe (2) | Wilburn Medical | WUSA/120 | One syringe can be used to inject PBS and one for PFA (during transcardial perfusion) |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 10010001 | For transcardial perfusion. |
22 G catheter | Med Vet International | 50-209-1694 | Use to place a tail vein catheter. |
97% Isoflurane | Thermo Scientific Chemicals | 247-897-7 | While rat is under isoflurane, be careful not to administer too much. A high dose can euthanize the rat. |
Betadine 7.5% | Purdue Products | 4677 | |
Class A clear threaded glass vial | Fisherbrand | 14-955-314 | Use to store spinal cord extraction. |
Digital balance scale | Kent Scientific | SCL-4000 | |
Electric razor | Wahl Home Products | 79449-200 | Shave fur off skin at incision site before surgery |
Eosin-Y with Phloxine | Epredia | 71304 | |
Evans blue dye | MP Biomedicals | 02151108-CF | Although it is non-toxic, it will stain skin blue if direct contact occurs. |
Fixation Plate Assembly with 0.5 mm Forceps | PSI Impactors | 7001-2 | Affix the stereotactic arm to this frame |
Gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | |
Heating pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
Hematoxylin | Epredia | 7211 | |
Iris Scissors with Angled Blades | ProDentUSA | 12-15315 | |
Isoflurane induction system | Kent Scientific | SOMNO-RATKIT | |
Laser targetting apparatus | NA | custom | CAD design file provided in supplemental section. Simply place a laser inside the apparatus created from the file. |
Lubricating eye ointment | Systane | N/A | |
Luer Lock 3-Way Stopcock | Sigma | SAS7521-10EA | Can use to fill water cone through inlet valve |
Lumason microbubbles kit | Bracco | 0270-7099-16 | |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
Microtome | Epredia | 23-900-671 | |
Mounting medium with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-2000-2 | |
Mylar membrane | Chemplex | 3016 | Can cut membrane to appropriate size if too large for cone |
NeuroFUS 2.52" diameter 250 kHz transducer | Sonic Concepts | CTX-250 | Transducer system includes custom water cone and probe holder |
NeuroFUS PRO v2.0 system | Sonic Concepts | NFS102v2 | Includes Transducer Power Output, Matching Network and associated cables |
Offset Bone Nippers | Fine Science Tools | 16101-10 | Use to remove spinous processes and laminae for laminectomy |
Paraffin | Polysciences | 24364-1 | Can place spinal cord sample in paraffin to slice into thin sections for histology. |
Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J61899-AK | For transcardial perfusion. |
Rat Surgical Kit | Kent Scientific | INSRATKIT | Consists of tweezer #5, needle holder, McPherson-Vannas scissors, Iris scissors, ALM self-retaining retractors, Iris forceps, and blunt probe. These products should be sufficient to perform a laminectomy. |
Razor blade | Fisherbrand | 12-640 | Use to cut spinal cord extraction to desirable length and split section down midline. |
Rectal thermometer | Kent Scientific | RET-2 | Maintain rat temperature between 35.9–37.5 °C |
Rubber band | Fisherbrand | 50-205-1983 | |
Single animal vaporizer unit | Kent Scientific | SF-01 | |
Stereotactic arm | Kopf Instruments | Model 963 | |
Sterile absorbent pad | McKesson | 4033-CS150 | Place under rat and above heating pad and fixation plate before laminectomy |
Ultrasound gel | Aquasonic | PLI 01-34 | Ensure gel is free of bubbles to the best of your ability. |