מוצגת כאן שיטה ניתנת לשחזור, משתלמת וחזקה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל סימפונות ראשוניים עבור ביו-בנקאות לטווח ארוך ויצירת תאי אפיתל ממוינים על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל.
שכבת תאי האפיתל של דרכי הנשימה מהווה את המחסום הראשון בין רקמת הריאה לסביבה החיצונית ולכן היא חשופה כל הזמן לחומרים נשאפים, כולל גורמים זיהומיים ומזהמי אוויר. שכבת האפיתל של דרכי הנשימה ממלאת תפקיד מרכזי במגוון רחב של מחלות ריאה אקוטיות וכרוניות, וטיפולים שונים המכוונים לאפיתל זה ניתנים בשאיפה. הבנת תפקידו של אפיתל בפתוגנזה וכיצד ניתן למקד אותו לטיפול דורשת מודלים חזקים ומייצגים. מודלים של תרביות אפיתל חוץ גופיות נמצאים בשימוש הולך וגובר ומציעים את היתרון של ביצוע ניסויים בסביבה מבוקרת, חשיפת התאים לסוגים שונים של גירויים, רעלים או גורמים זיהומיים. לשימוש בתאים ראשוניים במקום בקווי תאים אימורטליים או סרטניים יש יתרון בכך שתאים אלה מתמיינים בתרבית לשכבת תאי אפיתל מקוטבת פסאודוסטראטית עם ייצוג טוב יותר של האפיתל בהשוואה לקווי תאים.
מוצג כאן פרוטוקול חזק, שעבר אופטימיזציה בעשורים האחרונים, לבידוד ותרבית של תאי אפיתל בדרכי הנשימה מרקמת הריאה. הליך זה מאפשר בידוד מוצלח, הרחבה, תרבית והתמיינות ליחה של תאי אפיתל ראשוניים של הסימפונות (PBECs) על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל (ALI) וכולל פרוטוקול לביו-בנקאות. כמו כן, מתואר אפיון תרביות אלה באמצעות גנים של סמן ספציפי לתא. תרביות ALI-PBEC אלה יכולות לשמש למגוון יישומים, כולל חשיפה לעשן סיגריות שלמות או מתווכים דלקתיים, ותרבית משותפת / זיהום עם וירוסים או חיידקים.
הפרוטוקול המובא בכתב יד זה, הממחיש את ההליך באופן שלב אחר שלב, צפוי לספק בסיס ו/או התייחסות למעוניינים להטמיע או להתאים מערכות תרבות כאלה במעבדתם.
תפקידו של אפיתל דרכי הנשימה במגוון מחלות ריאה חריפות וכרוניות תואר בסקירות שונות 1,2,3,4,5,6,7. תרביות ממוינות היטב של תאי אפיתל בדרכי הנשימה הן כלי חשוב לפענוח תפקידו של אפיתל דרכי הנשימה. ממשק אוויר-נוזל (ALI) תרבית תאי אפיתל בדרכי הנשימה מיושמת באופן נרחב כדי לקדם את ההתמיינות של תאי אפיתל בסיסיים של דרכי הנשימה ובכך לחקור את אפיתל דרכי הנשימה באופן אמין במבחנה 8,9. בשנים האחרונות, השימוש במודלים כאלה גדל עוד יותר כתוצאה מיוזמות מחקר חדשות הקשורות למגפת הקורונה ומעבר עולמי למחקר ללא בעלי חיים. לכן, השימוש המוגבר בקו תאי מודל זה מדגיש את הצורך בשיתוף נהלים וחוויות כדי להשיג תוצאות חזקות. זה יאפשר גם השוואת תוצאות בין קבוצות מחקר. החוסן של ההליך הוא מאפיין המפתח ולכן צריך להיות נתון לבקרת איכות. מספר מעבדות השקיעו בפיתוח פרוטוקולים לגידול תאי אפיתל ראשוניים בדרכי הנשימה ב-ALI. ניתן להפחית את הזמן, המאמץ והתקציב הנדרש כאשר נהלים אלה משותפים בפירוט. פרטים אלה כוללים, למשל, את הבחירה של פלסטיק תרבית תאים ומדיה שסופקו על ידי יצרנים שונים, שכן זה נמצא להשפיע על המאפיינים של התרביות שהתקבלו10,11,12. זה מדגיש את החשיבות של שיתוף חוויות ופרטים של נהלי תרבות, שכן בהיעדר תובנות כאלה, התוצאות עשויות להיות מושפעות ו / או מאמצי אימות במעבדות שונות עלולים להיפגע.
אפיתל הריאה האנושי מורכב מסוגי תאים שונים, כולל סוגים עיקריים כגון תאי בסיס, תאים ריסונים, תאי גביע ותאי מועדון. על מנת לחקות באופן אמין את שכבת תאי האפיתל בדרכי הנשימה במבחנה, סוגי תאים אלה צריכים להיות מיוצגים במודלים של תרבית, והקיטוב והתפקוד שלהם נשמרים13,14,15,16. ההבנה כי מאפייני התורם (כולל מצב המחלה) והמקור האנטומי של התאים (כלומר, האף, קנה הנשימה, דרכי הנשימה הגדולות והקטנות) עשויים להשפיע על הרכב התאים ועל התגובות התפקודיות של תרבית התאים חשובה לא פחות. מומחיות ופרקטיקה רלוונטיות הן תנאי מוקדם לתרבית מוצלחת של תאי אפיתל ראשוניים בדרכי הנשימה ולהעריך את איכות התרבית הן באופן אינטואיטיבי (על ידי בדיקה חזותית במהלך התרבית) והן כמותית. מטרת תרומה זו היא לספק שיטה חסכונית וחסכונית בזמן לבידוד ולתרבית של תאי אפיתל ראשוניים של הסימפונות האנושיים (PBECs) שניתן ליישם גם בתרבית של תאי אפיתל קנה הנשימה ודרכי נשימה קטנות. בנוסף לתיאור שיטה לבידוד תאים כאלה מרקמת ריאה שנכרתה, מוצגת ונדונה שיטה להרחבה וביו-בנקאות, ולבסוף להקמה ואפיון של תרבית ALI מובחנת היטב בתוך עלות ופרק זמן סבירים.
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר בידוד של תאי אפיתל סימפונות אנושיים מרקמת ריאה שנכרתה, שיטה להתרחבות אופטימלית של תאים ללא אובדן פוטנציאל התמיינות, הליך שימור בהקפאה, והליך ליצירת תרביות ALI-PBEC ממוינות היטב. יתר על כן, ניתן תיאור של בקרת איכות, כמו גם הוראות לניטור והערכה של ALI-PBECs מובחנים.
הפרוטוקול המתואר מתחיל בטבעת סימפונות תקינה מבחינה מקרוסקופית, נטולת גידולים, הנכרתת מאונת ריאה מחולים שעברו ניתוח הקשור לאבחון סרטן הריאות שלהם. לכן יש לציין כי טבעות אלה בהחלט לא יכולות להיחשב כרקמה בריאה, ולכן עשויות להשפיע על מאפייני תרבית התא. מקורות חלופיים להשגת תאי אפיתל של הסימפונות כוללים שימוש בביופסיות סימפונות, צחצוח סימפונות או רקמות מתורם מושתל או ריאות מושתל. ללא קשר למקור, בעת שימוש ברקמת ריאה יש לקחת בחשבון סיכון לזיהום מיקרוביאלי, ולכן אנטיביוטיקה משמשת באמצעי התרבית השונים כדי להפחית את הסיכון לזיהום מיקרוביאלי של תרבית התא. בפרט, מיקופלסמה היא סיכון גבוה ונפוץ בתרבית תאים, בגלל מגוון רחב של השפעות על תרבית תאים, עמידות לאנטיביוטיקה הנפוצה בתרבית תאים, והעובדה כי זיהום מיקופלסמה יכול להיות מאושר רק על ידי בדיקות זיהוי מיקופלסמה. לכן, בשלב הראשוני של תרבית תאים לאחר בידוד התאים מרקמת הריאה, נעשה שימוש בניסוח האנטי-מיקרוביאלי רחב הספקטרום פרימוצין, ובמהלך תהליך התרבית, דגימות שנבחרו באופן אקראי נבדקות לנוכחות מיקופלסמה.
הליך הבידוד המתחיל בטבעת סימפונות מספק חומר מוצא מספיק כדי לאפשר את מידת ההתרחבות של תאים ראשוניים אלה הדרושים להתחלת תרביות ב- ALI מבלי לפגוע ביכולת ההתמיינות. עם זאת, התחלת ההתרחבות של תאי אפיתל מבודדים עם מספר מוגבל של תאים עלולה להוות בעיה עם השגת מספר מספיק של תוספות עם מספיק תאים שניתן לזרוע עבור תרבית ALI. תרבית ממושכת ומעבר חוזר ונשנה של תאים ראשוניים עלולים לגרום להזדקנות משוכפלת. הוצעו פתרונות שונים כדי להתגבר על מגבלה זו. Horani et al. הראו כי מעכב Rho kinase (ROCK) Y-27632 הגביר את התפשטות תאי הבסיס30, Mou et al. השתמשו בעיכוב Smad כפול כדי להרחיב תאי גזע בסיסיים תוך שמירה על המאפיינים של שכבת תאי אפיתל ממוינים 31, ו Sachs et al. פיתחו מערכת אורגנואידים של דרכי הנשימה שניתן להשתמש בה כדי להרחיב תאי אפיתל של דרכי הנשימה ולשמור על פוטנציאל ההתמיינות שלהם במהלך מעברים מרובים32. השיטה האחרונה שימשה גם להרחבת תאים ממקורות בעלי מספר תאים נמוך מאוד, כגון שואבי קנה הנשימה (TAs) מפגים (גיל <28 שבועות להריון) ונוזל שטיפה ברונכואלבאולרי (BAL), לפני העברתם לתרבית ALI כמתואר כאן33. נמצא כי תאים שבודדו מ-BAL ו-TAs הראו יכולת התמיינות דומה לתאים שנוצרו מרקמת הסימפונות, אם כי הבדלים נצפו כאשר ההתמיינות הייתה מוטה לכיוון תרביות המכילות יותר תאי גביע או יותר באמצעות עיכוב איתות Notch או ציטוקין Th2 IL-1333. לכן מומלץ שאם ALI-PBECs מתורבתים מחומר מוצא עם מספרי תאי אפיתל נמוכים בגישות דומות, לבדוק תמיד את התרביות עבור קריטריוני האיכות הבסיסיים, כפי שנדון בסעיף 6 של הפרוטוקול. חשוב לציין, השימוש בתאי הזנה עשוי גם לסייע בהשגת מספר תאים גדול יותר, דבר חיוני בסביבה להנדסת פיגומים להשתלה שבה זמן ומספר תאים חיוניים. הדבר מומחש על ידי מחקר שבו תאי אפיתל אוטולוגיים גודלו בתרבית מביופסיות שמקורן בחולה עם מחלת קנה הנשימה, ותאים הורחבו במהירות בנוכחות שכבת הזנה עוברית מורין (פיברובלסטים 3T3-J2 מומתים מיטוטית ) והמעכב הנ”ל של מסלול Rho/ROCK (Y-27632)34. תרבית התאים שהתקבלה נמצאה שימושית לאכלוס מחדש של פיגומי קנה הנשימה, ולכן ניתן לראות בכך פרוטוקול מתאים למודל השתלה.
בעת שימוש בפרוטוקול המתואר בתרומה זו, אך גם בעת שימוש בפרוטוקולי תרבות אחרים, באופן בלתי נמנע מוצגת הטיית בחירה. חשוב להבין כי הבדלים בפרטי הפרוטוקול, כגון מוצא התאים המשמשים ליזום תרביות, הרכב בינוני ופרטי פרוטוקול אחרים, יכולים להוביל לשינויים בהרכב התא של התרביות ובכך לשינויים בתגובת תרבית ALI33,35. בנוסף, הבדלים בתכונות התא נצפו גם בעת השוואת מדיה שונה להבחנה בין תאי דרכי הנשימה10,11. כאשר השוו בין PneumaCult לבין מדיום cBD, נצפו הבדלים בסמני mRNA של תאי גביע ותאי מועדון, ערכי TEER ועובי שכבת התא. בהתבסס על תצפיות אלה, למרות היעדר ביסוס סטטיסטי, בשל מספר התורמים הנמוך בו נעשה שימוש, ההרכב הבינוני אינו ידוע ללקוחות, והעלויות הגבוהות יותר של מדיום PneumaCult, הוחלט במעבדה שלנו להשתמש בתווך cBD.
כפי שנדון, תאים ניתן להרחיב תחילה באמצעות תרבית אורגנואידים ולאחר מכן להעביר למערכת החדרת 2D ALI. זה חשוב, שכן אורגנואידים אפיתל דרכי הנשימה אינם מתאימים לחשיפה לחומרים הנישאים באוויר, ואילו השימוש במערכת ALI2D מאפשר להעריך את ההשפעה של חומרים הנישאים באוויר כגון עשן סיגריות 23,36 על תאי אפיתל של דרכי הנשימה בתרבית. גישה שונה לביסוס תרביות תאי אפיתל בדרכי הנשימה של ALI היא יצירת תאי אפיתל בדרכי הנשימה על ידי התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSCs)37. בפרוטוקולים כאלה, בשלב הסופי של פרוטוקול ההתמיינות לאחר התמיינות לאבות דרכי הנשימה הפרוקסימליות, תאים יכולים להיות ממוינים על ידי תרבית ל- ALI באמצעות הליכים דומים לאלה המתוארים כאן.
בפרוטוקול הנוכחי, מדיום cBD משמש לתרבות ב- ALI. cBD medium הוא מדיום ללא סרום כי הוא מוכן על ידי הוספת תערובת של תוספי מזון שונים, בהשראת Fulcher et al.38 , כמו גם מחקרים אחרים. תמיסת התוסף מכילה 52 מיקרוגרם/מ”ל תמצית יותרת המוח מפרות (BPE), 0.5 מיקרוגרם/מ”ל הידרוקורטיזון, 0.5 נ”ג/מ”ל EGF אנושי, 0.5 מיקרוגרם/מ”ל אפינפרין, 10 מיקרוגרם/מ”ל טרנספרין, 5 מיקרוגרם/מ”ל אינסולין, 6.5 נ”ג/מ”ל טריודותירונין ו-0.1 נ”ג/מ”ל RA39. מכיוון ש-BPE היא תמצית רקמה ונתונה לשינויים חכמים באצווה, המדיום אינו יכול להיחשב כמדיום מוגדר במלואו, וגם אינו נטול בעלי חיים. מדיום תרבית תאים המוגדר במלואו עדיף כדי למזער את הבדלי אצווה לאצווה. לאור המעבר למחקר ללא בעלי חיים, חשוב שייעשו מאמצים לייצר מדיה מוגדרת שאינה מכילה מוצרים מן החי ובמחיר סביר לקהילה המדעית.
ניתן להשתמש במערכי ניסוי שונים המבוססים על מודל ALI, בהתאם לשאלת המחקר. לדוגמה, כדי לחקור את ההשפעה של תרכובות שעשויות להשפיע על תהליך ההתמיינות, ניתן לטפל בכך על ידי הוספת התרכובות לתרבות במהלך השלבים השונים של התרבות השקועה, במהלך ההתמיינות, או בשלב המובחן היטב. ההרכב התאי של תרבית ALI-PBEC יכול להיות מושפע על ידי הוספת תרכובות ספציפיות; לדוגמה, התמיינות ALI-PBECs בנוכחות IL-13 יוצרת תרבית עם יותר תאי גביע ופחות תאים ריסונים, בעוד שטיפול במעכב γ-secretase DAPT (המשמש לחסימת איתות Notch) במהלך התמיינות מביא לתרבית עם יותר תאים ריסונים על חשבון תאי גביע 23,40,41,42.
יתר על כן, חומרים כדי לעורר תאים או לחסום תהליכים מסוימים יכולים להיות מיושמים על התא הבסיסי או (בנפח קטן מאוד) על התא האפי של התרבית. תאים יכולים גם להיחשף לחומרים הנישאים באוויר מהצד האפיקאלי. עיצובי חשיפה כאלה שימשו לחקר ההשפעה של פליטת דיזל או עשן סיגריות שלמות על PBECs23,43,44. ניתן לקצור את המדיום בכל פעם שהמדיום משתנה כדי לפקח על חלבונים המופרשים בצד הבסיסי; כנ”ל לגבי הצד האפי של התאים שנשטף עם PBS תוך רענון המדיום הבסיסי. מה שנקרא שטיפה אפית הוא קציר אופציונלי dithioerythritol (DTE) מתווסף כדי לנתק את הריר המיוצר על ידי תאי גביע בצורה יעילה יותר. ניתן להשיג ליזטים של תאים לבידוד של סך כל החלבון, הרנ”א והדנ”א הכרומוזומלי והמיטוכונדריאלי. ניתן להמשיך ולחקור את התאים באמצעות נוגדנים לסמנים ספציפיים, על ידי חיתוך קרום הפוליאתילן טרפתאלט (PET) מתוספת הפלסטיק וחיתוך נוסף של קרום זה לחתיכות קטנות יותר עבור כתמים אימונופלואורסצנטיים מרובים45. יתר על כן, ציטומטריית זרימה או FACS ניתן להשתמש גם לאחר טריפסיניזציה של התאים בתוספות. בשלב ה-ALI ניתן לעקוב אחר התפתחות המחסום התאי על ידי מדידת ההתנגדות החשמלית ולאחר מכן חישוב ה-TEER, כאשר ההתנגדות החשמלית עומדת ביחס הפוך לשטח הפנים של החדרת הממברנה. החישוב מבוסס על חוק אוהם באמצעות הנוסחה הבאה: , כאשר Rm היא ההתנגדות החשמלית הנמדדת, Rb היא ההתנגדות החשמלית הבסיסית של אינסרט ללא ציפוי ותאים, ו- SA הוא שטח הפנים של הממברנה של העלון. מדידת ההתנגדות החשמלית באמצעות אלקטרודות EVOM2 ו-STX/מקל אכילה היא פשוטה אך תלויה מאוד בהליכי הטיפול בעת הכנסתה לבאר. כמו כן, הוצע כי צורת האלקטרודה משפיעה על מדידת פונקציית המחסום של שטח הפנים הגדול יחסית17.
שיפור נוסף במערכת תרביות תאי ALI, שמטרתו להגדיל את ייצוג הרקמה המדויק, כולל תרבית משותפת של סוגי תאים נוספים, כגון לויקוציטים, פיברובלסטים או תאי אנדותל46,47,48. נצפה כי תרבית משותפת של ALI-PBEC עם גרנולוציטים-מקרופאגים-גורם מגרה מושבה (GM-CSF) או מקרופאגים ממוינים M-CSF משפיעה במידה ניכרת על תגובות אפיתל מולדות ותיקון48. חשוב לציין כי במודלים כאלה coculture, תאימות בינונית יכולה להיות בעיה. מכיוון שהתווך המשמש לתרבית תאי אפיתל בדרכי הנשימה פותח במיוחד עבור PBECs ועשוי שלא להתאים באופן אופטימלי לסוגי תאים אחרים, יש צורך באופטימיזציה. סוג נוסף של התקדמות שנצפה בתחום הביולוגיה של דרכי הנשימה שעבורו ניתן להשתמש ב-PBEC מבודדים הוא השימוש בטכנולוגיית Organs-on-Chips (OoC)49,50. באמצעות טכנולוגיה זו ניתן ללמוד את השפעת הכוחות המכניים של הנשימה וזרימת הדם, כגון מתיחה, אוויר וזרימה בינונית 29.
שונות בין תורמים יכולה להיות משמעותית בעת שימוש ב- PBECs מתורמים שונים, ולכן חשוב לשקול שימוש בתאים ממספר תורמים כדי להסביר שונות זו במחקרי תרביות תאי אפיתל. מכיוון שתרבית ALI-PBEC גוזלת זמן וכרוכה בעלויות ניכרות, נבחנת האפשרות להקים תרביות ALI-PBEC על ידי ערבוב תאים מתורמים שונים בעלון תרבית תאים אחד. בדרך זו, ניסויי פיילוט ניתן לבצע בקלות באמצעות תאים ראשוניים, לפני ניתוח התגובות של תרביות שמקורן בתורמים בודדים שונים . בנוסף, ניתן לקבץ תורמים בעלי מאפיינים שונים (למשל, קטגוריית גיל שונה או מגדר שונה) למחקרי גישוש. בעת שימוש בתמהילי תורמים, חשוב לוודא כי קיימים מספר תאים שווה של תורמים שונים, כדי למנוע את האפשרות שתורם אחד שולט בתוצאות כתוצאה משיעור ריבוי גבוה יותר. לכן, תאים מתורמים בודדים מורחבים בנפרד ונזרעים בצפיפות גבוהה יותר באינסרט בהשוואה לתאי זריעה מתורם בודד, כדי למזער את ההתרבות באינסרט לפני המעבר ל- ALI. תגובות של תערובות תורמים ותורמים בודדים מקבילים הושוו על ידי לימוד קינטיקה של זיהום של SARS-CoV-2. באמצעות RT-qPCR וצביעה אימונופלואורסצנטית, נצפה כי תמהיל התורמים סיפק ייצוג טוב של התורמים הבודדים השונים, על ידי הצגת מספר דומה של חלקיקי וירוס המיוצרים ומספר דומה של תאים נגועים28.
כדי להפוך לחלופה מקובלת עבור מודלים של בעלי חיים, עריכה גנטית של תאי אפיתל סימפונות בתרבית צריכה להיות אפשרית51. נבדקת טכנולוגיית התאבכות RNA באמצעות RNA מפריע קטן (siRNAs) ב- ALI-PBECs, אולם מכיוון שהתאים צריכים להיות נגועים ב- siRNA במהלך השלב השקוע של התרבית, ההפלה אינה נשמרת מספיק במהלך תרבית ALI בגלל משך התרבית הארוך, אלא אם כן טרנספקציה של siRNA חוזרת לעתים קרובות במהלך התרבית52. עם זאת, siRNA יכול לשמש בהצלחה לשינוי ביטוי גנים בתאי בסיס שקועים. אחרים השתמשו בהצלחה בטכנולוגיית CRISPR/Cas9 כדי להשיג עריכת גנים בתרביות תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה ALI עם העברת ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) 53. בעת שימוש בטכניקות כאלה, חיוני כי התאים לשמור על יכולת ההתמיינות המלאה שלהם. מכיוון שלא ניתן לעבור תרביות תאים ראשוניות בדרכי הנשימה ללא הגבלת זמן, הרחבת השבט של התאים הערוכים גנטית אינה קלה והתוספת של תאים מדיום לבחירת תאים נגועים היא מסורבלת. לכן, קשה להשיג את המפלה הרצויה בכל התאים בתרבית. חלופה ליצירת שיבוטים נוקאאוט היא השימוש באסטרטגיות נוק-אאוט ב-hiPSCs54 והשימוש בתאים אלה ליצירת תאי אפיתל בדרכי הנשימה. חלופה נוספת, אם כי תת-אופטימלית, היא הקמת קו PBEC אימורטלי כדי להרחיב באופן קלונלי תאים ערוכים גנטית55.
הפרוטוקול המוצג כאן הוא אחת הדרכים ליצור ALI-PBEC מובחן היטב, אך גם פרוטוקולים אחרים נמצאו כמבססים תרבות כזו, עם הבדלים קטנים וגדולים יותר בהשוואה לפרוטוקול המוצג. לדעתנו, תיקוף מעבדתי של שיטות תרבית ובקרת איכות מחמירה חיוניים למערכת ALI-PBEC ולמערכות תרבית דומות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה, כדי להפוך לחלופה תקפה לניסויים בבעלי חיים.
The authors have nothing to disclose.
המחקרים המשתמשים במודל המתואר בתרומה זו נתמכו על ידי מגוון ארגוני מימון, כולל קרן הריאות הולנד, הארגון ההולנדי למחקר ופיתוח בריאות (ZonMw, מענק MKMD COVID-19), האגודה ההולנדית להחלפת ניסויים בבעלי חיים (Stichting Proefdiervrij, grant #114025007), כמו גם מענקי מחקר מחברות כמו Boehringer Ingelheim ו- Galapagos. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.
1,000 ohm test resistor | World Precision Instruments | N/A | Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter |
4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) | Tocris | 4011 | Used in cBD medium |
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring |
Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit | PromoCell | C-21160 | Used to compare to cBD medium |
Bead Bath 20 Liter | Lab Armor | 74220-720 | Used to pre-warm cell culture solutions |
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit | LONZA | CC-3170 | Used to compare to cBD medium |
Bovine albumin fraction V (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | Used in coating solution |
Bovine pituitary extract (BPE) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) | ScienCell Research Laboratories | 3262 | Used in cBD medium |
Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) | ScienCell Research Laboratories | SCC3211-b | Used in cBD medium |
Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert | Corning | 3460 | Cell culture inserts used in the protocol |
Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear | CellQART made by SABEU | 9310412 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts | Greiner Bio-One | 82050-032 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658170 | Used to expand the number cells |
CFX Maestro 1.0 | Bio-Rad | N/A | Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System |
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855484 | qPCR detection system |
Chopstick electrode set | World Precision Instruments | STX2 | Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
CO2-Incubator | PHCbi | MCO-170AICUV-PE | Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures |
CO2-Incubator | Hereaus | Heracell 150 | Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures |
Coolcell Container | Corning | 432006 | Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2 |
Countess 3 Automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Used to count cells and determine the cell concentration |
Cryovials | Nalgene | 479-3224 | Used to cryopreserve cells in |
D-Glucose | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 101174Y | Used in soft trypsin |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Avantor VWR | 0231 | Used in cell freeze medium |
dNTP (10 mM) | Promega | U1515 | Used in the synthesis of cDNA |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose | STEMCELL Technologies | 36250 | Used in cBD medium |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine | LONZA | LOBE12-604F | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966029 | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
Epidermal growth factor (EGF) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 443885J | Used in soft trypsin |
EVOM2 Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | 91799 | Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
Fibronectin solution, Human | PromoCell | C-43060 | Used in coating solution |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Used in cBD medium |
Hanks balanced salt solution (HBSS) | ScienCell Research Laboratories | SCC0313 | Used to dissolve protease XIV |
IQ SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170887 | qPCR reagent |
Isoproterenol hydrochloride, (-)- | Sigma-Aldrich | I-6504 | Used in c-KSFM |
Keratinocyte-SFM (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005-034 | Used in c-KSFM |
Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | Automated RNA isolation system |
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument |
M-MLV Reverse transcriptase | Promega | M5301 | Used in the synthesis of cDNA |
M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer | Promega | M531A | Used in the synthesis of cDNA |
MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-10 | Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples |
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | Used in cBD medium |
Oligo(dT)15 | Qiagen | 79237 | Used in the synthesis of cDNA |
Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) | ScienCell Research Laboratories | SCC0513 | Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | LUMC pharmacy | N/A | Used in different steps of the protocol |
Pneumacult-ALI Medium | STEMCELL Technologies | 05002 | Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium |
Pneumacult-Ex Plus Medium | STEMCELL Technologies | 05040 | Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium |
Primer, ATP5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA |
Primer, ATP5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT |
Primer, FOXJ1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA |
Primer, FOXJ1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC |
Primer, MUC5AC, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC |
Primer, MUC5AC, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG |
Primer, MUC5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT |
Primer, MUC5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG |
Primer, RPL13A, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG |
Primer, RPL13A, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC |
Primer, SCGB1A1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC |
Primer, SCGB1A1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA |
Primer, TP63, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG |
Primer, TP63, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium |
Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring |
RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor | Promega | N2515 | Used in the synthesis of cDNA |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI) | Sigma-Aldrich | T9128 | Used to inhibit the action of soft trypsin |
T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Used in the synthesis of cDNA |
TissueSAFE plus | MILESTONE MEDICAL | N/A | Vacuum transfer system for biological specimens |
Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to count live- and dead cells |
Trypsin 1:250 | Thermo Fisher Scientific | 27250-018 | Used in soft trypsin |
Type I collagen solution (PureCol) | Advanced BioMatrix | 5005-B | Used in coating solution |
Universal container, PP, with PE screw cap | Avantor VWR | 216-2053 | Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring |