В настоящем протоколе описан простой и эффективный метод идентификации метаболитов 2,4-дибромфенола в растениях.
Сельскохозяйственные культуры могут подвергаться интенсивному воздействию органических загрязнителей, поскольку почва является основным поглотителем загрязняющих веществ, выбрасываемых в окружающую среду. Это создает потенциальное воздействие на человека при употреблении в пищу пищевых продуктов, накопленных загрязняющими веществами. Выяснение поглощения и метаболизма ксенобиотиков в сельскохозяйственных культурах имеет важное значение для оценки риска пищевого воздействия на людей. Однако для таких экспериментов использование интактных растений требует длительных экспериментов и сложных протоколов пробоподготовки, на которые могут влиять различные факторы. Каллусные культуры растений в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения (HRMS) могут обеспечить решение для точной и экономящей время идентификации метаболитов ксенобиотиков в растениях, поскольку это позволяет избежать вмешательства со стороны микробного или грибкового микроокружения, сократить продолжительность обработки и упростить матричный эффект интактных растений. 2,4-дибромфенол, типичный антипирен и эндокринный разрушитель, был выбран в качестве модельного вещества из-за его широкого распространения в почве и его способности к поглощению растениями. При этом каллус растения был получен из семян асептики и подвергнут воздействию стерильной питательной среды, содержащей 2,4-дибромфенол. Результаты показали, что после 120 ч инкубации в каллусных тканях растений было идентифицировано восемь метаболитов 2,4-дибромфенола. Это свидетельствует о том, что 2,4-дибромфенол быстро метаболизировался в каллусных тканях растений. Таким образом, платформа каллусных культур растений является эффективным методом оценки поглощения и метаболизма ксенобиотиков в растениях.
Все большее число органических загрязнителей выбрасывается в окружающую среду из-за антропогенной деятельности1,2, и почва считается основным поглотителем этих загрязнителей 3,4. Загрязняющие вещества в почве могут поглощаться растениями и потенциально передаваться организмам более высокого трофического уровня по пищевым цепям, непосредственно попадая в организм человека при употреблении в пищу сельскохозяйственных культур, что приводит к непреднамеренному воздействию 5,6. Растения используют различные пути метаболизма ксенобиотиков для детоксикации7; Выяснение метаболизма ксенобиотиков имеет важное значение, поскольку оно контролирует фактическую судьбу загрязняющих веществ в растениях. Поскольку метаболиты могут выводиться листьями (в атмосферу) или корнями, определение метаболитов на самых ранних стадиях воздействия, следовательно, дает возможность протестировать большее количество метаболитов8. Однако исследования с использованием интактных растений требуют длительных экспериментов и сложных протоколов пробоподготовки, на которые могут влиять различные факторы.
Таким образом, каллусные культуры растений являются хорошей альтернативой для изучения метаболизма ксенобиотиков в плантах, так как они могут значительно сократить время лечения. Эти культуры исключают микробную интерференцию и фотохимическую деградацию, упрощают матричный эффект интактных растений, стандартизируют условия культивирования и требуют меньших экспериментальных усилий. Каллусные культуры растений успешно применяются в качестве альтернативного подхода в метаболических исследованиях триклозана9, нонилфенола10 и тебуконазола8. Эти исследования показали, что метаболические паттерны в каллусных культурах были аналогичны таковым у интактных растений. В данном исследовании предложен метод эффективной и точной идентификации метаболитов ксенобиотиков в растениях без сложных и трудоемких протоколов. Здесь мы используем каллусные культуры растений в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения для анализа метаболитов с низкоинтенсивными сигналами11,12.
С этой целью каллусные суспензии моркови (Daucus carota var. sativus) подвергали воздействию 100 мкг/л 2,4-дибромфенола в течение 120 ч в шейкере при 130 об/мин и 26 °C. 2,4-дибромфенол был выбран из-за его разрушительной эндокринной активности13 и широкого распространения в почве14. Метаболиты были выделены и проанализированы методом масс-спектрометрии высокого разрешения. Предложенный здесь протокол позволяет исследовать метаболизм in planta других типов органических соединений, которые могут быть ионизированы.
Данный протокол был разработан для эффективной идентификации биотрансформации ксенобиотиков в растениях. Критическим этапом этого протокола является культивирование каллуса растения. Самой сложной частью является дифференциация и поддержание каллуса растения, потому что каллус ра…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (21976160) и Исследовательским проектом по применению технологий общественного благосостояния провинции Чжэцзян (LGF21B070006).
2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
Amber glass vials | Waters | ||
Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
Centrifuge | Thermo Fisher | ||
DB-5MS capillary column | Agilent | ||
Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
Freeze dryer | SCIENTZ | ||
High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
Methanol | Sigma-Aldrich | ||
MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |