Cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada

Todos los protocolos de cuidado animal fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad de Columbia Británica de acuerdo con las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado Animal. 1. Digestión cerebral para el aislamiento de la microglía Figura 1: Diagrama de flujo simple del protocolo. En primer lugar, los ratones se perfunden transcardíacamente con HBSS y se disecciona el cerebro. Luego, el cerebro se disocia a través de la digestión química y la disrupción mecánica para dar como resultado un homogeneizado de una sola célula. La fracción inmunoenriquecida se recolecta a través de un gradiente de densidad discontinuo, después de lo cual las células se tiñen para P2RY12. Las células teñidas se clasifican 1) mediante clasificación de células activadas fluorescentes (FACS) para realizar análisis de ARN o análisis de proteínas posteriores y/o 2) se fijan, permeabilizan y tiñen para proteínas intranucleares. El nivel de proteína se cuantifica mediante la mediana de la intensidad de fluorescencia en el canal de interés determinada por citometría de flujo. Las cajas de color azul son parte del paso 1 del protocolo: Digestión cerebral para el aislamiento de la microglía. Los cuadros de color rojo forman parte del paso 2 del protocolo: Tinción de flujo intranuclear para el análisis de expresión de proteínas. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Preparación de reactivosNOTA: Si planea una extracción para recolectar ARN y células para el análisis de HPTM, consulte la sección 1.7.1 para ver las modificaciones para incluir inhibidores de la transcripción y la traducción. Sin embargo, esto no es necesario si solo se evalúa la señal de la proteína, ya que las células están en gran medida inactivas cuando se mantienen en hielo.Tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (20 ml por muestra): Disuelva la albúmina sérica bovina (BSA) en 1 solución salina equilibrada Hanks (HBSS) para crear una solución BSA al 2%. Disuelva el EDTA hasta una concentración final de 1 mM en la solución de BSA al 2%. Esterilizar con un filtro de 0,2 μm y almacenar a 4 °C hasta 1 semana antes de su uso. Tampón de digestión (1 mL por muestra): Reconstituir un vial de papaína en HBSS a una concentración final de 20 U/mL en L-cisteína 1 mM con EDTA 0,5 mM. Actívelo a 37 °C durante un mínimo de 10 minutos o hasta que esté listo para digerir el tejido. Justo antes de su uso, añadir DNasa I a la solución de papaína activada hasta una concentración final de 200 U/mL. Prepáralo el día del experimento y no lo guardes. Solución de gradiente de densidad isotónica (5,5 ml por muestra): Añadir 10x HBSS al medio de gradiente de densidad fría hasta una concentración final de 1x HBSS, lo que da como resultado una densidad final de 1,117 g/ml. Vórtice para mezclar durante al menos 30 s antes de su uso. Coloque sobre hielo hasta su uso. Solución de gradiente de densidad al 37% (4 mL por muestra): Añadir gradiente de densidad isotónica a 1x HBSS para obtener una concentración final del 37% con una densidad final de 1,043 g/mL. Agregue 20 μL de rojo de fenol por cada ml de gradiente de densidad del 37% para hacer una solución rosa para la visualización durante la estratificación. Vórtice durante al menos 30 s antes de su uso. Coloque sobre hielo hasta su uso. Solución de gradiente de densidad al 70% (2 ml por muestra): Añadir gradiente de densidad isotónica a 1x HBSS para obtener una concentración final del 70% con una densidad final de 1,082 g/ml. Agregue 5 μL de azul de tripán por cada ml de medio de densidad al 70% para hacer una solución azul para la visualización durante la estratificación. Vórtice durante al menos 30 s antes de su uso. Coloque sobre hielo hasta su uso. Perfusión y disección cerebralNOTA: El protocolo de perfusión es similar al de Posel et al., que presenta una representación en video de la toracotomía de ratón, la perfusión transcardíaca y la extirpación del cerebro21. En este caso, utilizamos ratones machos y hembras adultos C57BL/6J (10-15 semanas de edad, 20-30 g), pero este protocolo se puede utilizar para realizar una toracotomía a cualquier ratón. Todos los procedimientos con animales deben ser aprobados por el comité de ética institucional antes de realizar experimentos.Anestesia de ratón: Anestesiar ratones con isoflurano al 4% en oxígeno al 100% hasta que pase el plano de anestesia quirúrgica, lo que se puede confirmar con un pellizco en el dedo del pie, o una falta de reflejo al pellizcar firmemente el pie del ratón. Coloque el ratón boca arriba y sujete firmemente sus cuatro patas hacia abajo en la tabla de disección quirúrgica colocada inclinada en una bandeja de plástico, asegurándose de que la nariz esté asegurada en el cono nasal de isofluorano. Después de la transferencia, asegúrese de que el animal aún haya pasado el plano quirúrgico de la anestesia antes de continuar. Toracotamía de ratón: Agarre y levante la piel abdominal con fórceps y haga una incisión poco profunda a través de la piel y la pared abdominal para exponer la xifoidea sin dañar la aorta descendente ni ningún órgano subyacente. Sujete la xifoidea con pinzas y haga incisiones laterales debajo de la caja torácica para exponer el diafragma y el hígado. Haga cortes cuidadosos y poco profundos a través del diafragma a lo largo de la caja torácica con tijeras finas y a través de la caja torácica con tijeras de tejido y sujete el esternón a la estación quirúrgica cerca de la cabeza del ratón para exponer el corazón y los pulmones para la perfusión transcárdica. Perfusión transcárdica: Prepare una bomba de perfusión peristáltica y coloque una aguja de 26,5 G en un extremo del tubo. Prepare el tubo para el procedimiento insertando un extremo del tubo en un vial de 1x HBSS frío y encendiendo la bomba para llenar completamente el tubo con 1x HBSS. Mientras sostiene el corazón con pinzas romas, inserte la punta de una aguja 26.5G con el tubo de perfusión adjunto en el ventrículo izquierdo del corazón y haga una pequeña incisión en la aurícula derecha. Encienda la bomba de perfusión para perfundir cuidadosamente el ratón a una velocidad de ~2-4 ml/min con al menos 15-20 ml de 1x HBSS frío.NOTA: A menudo se indica una perfusión completa cuando el hígado comienza a eliminar la sangre y adquiere el mismo color que el corazón. Extracción de cerebro: Decapitar al ratón con unas tijeras de disección de tejidos y hacer una incisión en la línea media del cuero cabelludo desde el cuello hasta la nariz. Pele los colgajos de piel hacia los lados para exponer el cráneo y eliminar el exceso de tejido y huesos en el extremo caudal del cráneo con unas tijeras de disección. Desliza con cuidado una hoja de las tijeras debajo del cráneo en el foramen magnum con el lado afilado hacia el hueso y corta con cuidado la línea media hacia la nariz. Haz cortes laterales tanto en la base del cráneo como cerca de la nariz con unas tijeras de disección. Con pinzas finas, dale vida al cráneo desde la línea media hacia el exterior para romper las piezas del cráneo y exponer el cerebro. Levante suavemente el cerebro con una espátula y colóquelo sobre papel de disección. Disección del cerebro: Coloque el cerebro en un pedazo de papel seca de disección humedecido con 1x HBSS encima de una placa de Petri cerrada llena de hielo. Retire el cerebelo y divida en dos los hemisferios cerebrales con una cuchilla de afeitar limpia. Extirpa el tronco encefálico, el cuerpo estriado y la materia blanca de cada hemisferio, manteniendo intactos el hipocampo y la corteza suprapuesta. Transfiera los hemisferios que contienen tejido aislado de la corteza y el hipocampo a un tubo de 15 ml con 5 ml de HBSS frío 1x y manténgalo en hielo.NOTA: Es importante realizar las disecciones lo más rápido posible para que el tejido permanezca frío con no más de 2 minutos entre la decapitación y la colocación final del tejido diseccionado en 1x HBSS en hielo. Si se aísla la microglía de varios animales, los cerebros se pueden almacenar en hielo en 1x HBSS durante ~ 1 h antes de proceder con el procesamiento de toda la cohorte de animales para la digestión, etc. Digestión y homogeneización del cerebroDisociación mecánica y química: Coloque el tejido cerebral de cada ratón y 1 ml de tampón de digestión en placas de Petri individuales sobre hielo. Con una hoja de bisturí limpia, corte bien el cerebro en trozos pequeños (<1 mm). Corte la punta de una pipeta de transferencia de plástico y transfiera con cuidado cada uno de los sesos picados a pocillos separados dentro de una placa de 24 pocillos en hielo. Cubra la placa con film flexible transparente e incube en hielo durante 30 min.NOTA: Cuando se pica correctamente, el tejido cerebral se asemeja al ajo bien picado. Homogeneización de onzas: Transfiera la solución cerebral digerida de cada pocillo a homogeneizadores individuales de onzas de vidrio de 7 ml en hielo, cada uno lleno con 5 ml de tampón FACS frío. Resalte cada cerebro suavemente con el mortero suelto (A), aproximadamente 30-40 veces, hasta obtener una suspensión de una sola célula. Después de rociar con el mortero A, remogue suavemente con el mortero apretado (B) 3-4 veces para asegurar una suspensión de una sola celda.NOTA: No empuje el mortero más de 3/4 del camino hacia abajo para evitar aplastar el tejido en la parte inferior del homogeneizador. La solución final debe ser opaca y lechosa.NOTA: Si se digieren varios cerebros en un solo experimento, programe la transferencia del digesto cerebral al tampón FACS de modo que cada muestra esté solo en el tampón de digestión durante 30 minutos. La digestión excesiva puede provocar la escisión de las proteínas de la superficie, lo que reduce la unión y la señal de los anticuerpos posteriores. Obtención de un fragmento enriquecido con inmunidadEstablecimiento del gradiente de densidad: Transfiera el homogeneizado de cada cerebro a tubos de polipropileno separados de 15 mL y agregue 2.125 mL de gradiente de densidad isotónica y supere a 8.5 mL con tampón FACS para cada uno para obtener una concentración final de gradiente de densidad del 25%. Invierta suavemente los tubos de 15 ml 20x para mezclar bien. Utilizando una pipeta de transferencia graduada estrecha, aplique suavemente 4 ml de gradiente de densidad del 37 % en cada tubo, teniendo mucho cuidado de establecer capas limpias. Cambie las pipetas de transferencia y coloque suavemente 2 ml de gradiente de densidad del 70 % (Figura 2A). Pasar a una centrífuga enfriada a 4 °C y centrifugar a 500 x g durante 20 minutos con la rampa de frenado puesta a cero. Recogida de fragmentos enriquecidos con sistema inmunitario: Con pipetas de transferencia limpias, aspire suavemente la mielina desde la parte superior del volumen en el tubo de 15 ml con una pipeta de transferencia limpia y deséchela. Recoja cuidadosamente el fragmento superior del gradiente de densidad en un tubo de polipropileno limpio de 15 ml con una pipeta de transferencia. Recoja cuidadosamente el fragmento enriquecido con sistema inmunitario (1,5 ml por encima y 1,5 ml por debajo de donde se encuentran las capas de gradiente de densidad del 70 % y el 37 %) en un nuevo tubo de polipropileno de 15 ml (Figura 2B). Agregue 10 ml de tampón FACS a la muestra inmunoenriquecida para diluir el medio de gradiente de densidad e invierta el tubo suavemente 20 veces para mezclar bien.NOTA: Como las células tienden a adherirse a los lados del tubo, asegúrese de recoger todas las células de la muestra durante los pasos de recolección haciendo círculos lentamente con la pipeta a lo largo de los lados del tubo mientras recoge el líquido. Granular las células de la muestra inmunoenriquecida centrifugando los tubos de 15 ml en una centrífuga a 4 °C a 500 x g durante 10 min con el freno de rampa descendente puesto a cero. Inmediatamente después del final del centrifugado, retire el sobrenadante con cuidado, dejando aproximadamente 300 μL de líquido en el tubo de 15 ml, teniendo cuidado de no alterar el gránulo (que puede no ser visible). Recoja el sobrenadante en otro tubo de 15 mL para asegurarse de que las células se peletizaron en el centrifugado (deseche esta fracción una vez que se haya realizado la verificación con los recuentos celulares del gránulo resuspendido). Después de resuspender el gránulo celular en el volumen de 300 μL con una pipeta P1000, cuente las células con un hemacitómetro para estimar el rendimiento total de la célula. Figura 2: Obtención del fragmento inmunoenriquecido por gradiente de densidad discontinuo. (A) El homogeneizado cerebral se realiza a un medio de densidad del 25%, una capa inferior de 4 mL de color rosa medio de densidad 37% a través de rojo fenol y 2 mL de azul de color medio de densidad 70% a través de azul tripano. (B) Después de la centrifugación, las fracciones se han separado. La microglía descansa en la interfaz de fragmentos de medios de densidad del 37% y 70%. El fragmento de mielina se encuentra en la parte superior del tubo de 15 ml y se desechará. El fragmento superior se recoge como respaldo en caso de que falle el giro y no se recupere ninguna célula. Si eso ocurre, el gradiente se puede repetir usando esta fracción. La fracción inmunoenriquecida se recoge aguas abajo. La fracción inferior que contiene los glóbulos rojos permanece en el tubo y se desecha. (C) Figura de ejemplo que representa capas completas. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tinción de anticuerpos extracelularesBloqueo: Transfiera las celdas a una placa de 96 pocillos de fondo redondo sobre hielo y centrifugue a 500 x g con freno para pellet las celdas. Retire rápidamente el sobrenadante en el fregadero moviendo la placa para desechar el sobrenadante, dejando el gránulo de celda intacto en el fondo del pozo. Resuspender las células en 50 μL de tampón FACS con un reactivo de bloqueo del receptor FC CD16/32 anti-ratón utilizando una pipeta P200 (concentración final 10 μg/mL, factor de dilución 1:50) para evitar la unión inespecífica de anticuerpos a monocitos u otras células portadoras de FcR. Incubar durante 10 minutos en hielo. Tinción de anticuerpos: Prepare el volumen adecuado de una mezcla maestra 2x que contenga P2RY12-aloficocianina (APC; factor de dilución 1:50, concentración 4 μg/ml para una concentración final de pocillo de 1:100, concentración 2 μg/ml) y tinción violeta 525 viva muerta (factor de dilución 1:50 para una concentración final de pocillo de 1:100). Añadir 50 μL de la mezcla maestra de tinción a la suspensión celular (obtenida tras el bloqueo en la sección 1.5.1) e incubar la placa durante 30 min en la oscuridad sobre hielo.NOTA: Para este protocolo, presentamos la tinción de las células con P2RY12. En primer lugar, P2RY12 es un marcador homeostático de la microglía que puede ser regulado a la baja en ciertos contextos de enfermedad. Por ejemplo, los ratones modelo de Alzheimer 5XFAD tienen niveles de P2RY12 regulados a la baja, lo que podría dificultar su identificación22. Las tinciones alternativas que se pueden utilizar para el aislamiento incluyen Tmem119, Cd11b y CD4523. En segundo lugar, el conjugado fluorocromo APC se puede ajustar para adaptarse al panel de anticuerpos deseado. Sin embargo, la elección de un fluorocromo brillante, como APC o PE, ayudará a garantizar que las poblaciones positivas y negativas sean fácilmente distinguibles24. Después de la tinción, agregue 200 μL de tampón FACS directamente a cada pocillo para lavar las células. Girar a 500 x g a 4 °C para eliminar el sobrenadante con un golpecito. Vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón FACS con una pipeta P200, centrifugar a 500 x g a 4 °C y agitar la placa para eliminar el tampón de los pocillos. Preparación de los controles de flujo: Antes de la tinción, separe los volúmenes necesarios de células de cada muestra después del bloqueo en el paso 1.5.1 para los controles de flujo requeridos.NOTA: Se requieren controles de flujo para cada experimento a fin de establecer las puertas. Los controles de flujo se pueden tomar de un animal adicional o de una fracción de cada uno de los pozos experimentales. Al dividir las celdas, asegúrese de asignar suficientes celdas por control, ya que se requieren entre 10.000 y 30.000 celdas por control para establecer puertas con alta confianza.Hay tres controles de flujo relevantes: sin mancha, muertos vivos y control de isotipo P2RY12. Para el control sin manchas, no agregue ningún anticuerpo. En el control del isotipo P2RY12, tratar las células con colorante de viabilidad (1:100) y un anticuerpo de control del isotipo conjugado con APC (1:100). Para preparar el control de muertos vivos, coloque las células alícuotas en un pocillo separado y mueva la mitad del volumen celular a un tubo de 500 μL. Coloque el tubo de 500 μL en el congelador a -80 °C durante 5 minutos, luego colóquelo en la incubadora a 37 °C durante 5 minutos para matar las células. Devolver la alícuota de células muertas al pocillo de control de muertos vivos y teñir con un colorante de viabilidad de unión a aminas sobre violeta 525 (factor de dilución 1:100) para marcar las células muertas.NOTA: El protocolo está escrito para la tinción de placas con un método de movimiento rápido para la eliminación del sobrenadante. Sin embargo, esto requiere que el sobrenadante se elimine inmediatamente después de completar el giro y el movimiento debe realizarse con suficiente fuerza para eliminar rápidamente el sobrenadante sin perturbar el gránulo. Alternativamente, se pueden utilizar tubos libres de ARNasa/DNasa de 1,5 ml para la tinción, con las siguientes modificaciones: Transfiera las células al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y gránulos a 800 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar sobrenadante con pipetas. Consejo: Para mayor velocidad, una pipeta de transferencia de 5 ml con una punta P200 puede aspirar el sobrenadante de forma rápida y precisa. Al aspirar, compruebe si hay gránulos. Si el gránulo no es visible, deje 50 μL de sobrenadante y ajuste los cálculos en consecuencia. Al eliminar los anticuerpos, agregue FACS adicionales para aumentar la dilución de anticuerpos (1000 μL en lugar de 200 μL) para tener en cuenta la eliminación incompleta del sobrenadante. Dependiendo del citómetro, utilice los tubos de 1,5 ml para clasificar, lo que reduce la cantidad de suministros necesarios. Clasificación FACS para microglíaPreparación: Vuelva a suspender cada pocillo en 200 μL de tampón FACS con una pipeta P200 y transfiéralo a tubos de clasificación de flujo marcados y agregue tampón FACS hasta un total de 500 μL para una concentración de aproximadamente 5 x 105 eventos por ml. Almacenar en hielo en la oscuridad hasta el análisis. Prepare los tubos de clasificación posterior añadiendo 100 μL de tampón FACS como colchón para las células en tubos libres de ARNasa de 1,5 mL. Configuración del citómetro: Ordene las células en un clasificador de células de citometría de flujo configurado con la boquilla de 100 μm. Ordene las celdas usando 18-20 psi. Compuerta: En el citómetro, compuerta para el tamaño de la célula utilizando el área de dispersión lateral (SSC) frente a la altura de dispersión frontal (FSC) utilizando el control sin tinción para ayudar a distinguir los residuos, coloque SSC-A en un eje logarítmico para visualizar una población de células y la puerta de cerca para seleccionar las células (puerta S1; Figura 3). Para eliminar cualquier doblete, trace FSC-H vs FSC-W y compuerta cerca de la población celular eliminando cualquier residuo y doblete (puerta S2). Con el control de isotipo P2RY12, examine las células del canal APC y configure la puerta de autofluorescencia para determinar las células P2RY12+. Usando los controles sin tinción y muertos vivos, compuerta para las células que no son fluorescentes en violeta 525 nm como células vivas. Clasificación: Grafique violeta 525 nm vs APC y determine la población que es P2RY12+ y vive por FMO (MG). Clasifique esas celdas en el tubo de clasificación de publicaciones etiquetado (Figura 3). El porcentaje de ordenación final es de aproximadamente el 50 % del total de eventos, y la mayoría de las pérdidas totales de eventos son escombros eliminados en la puerta S1 (~ 70 % de los eventos son celdas; Tabla 1). Aislamiento y análisis de ARNInhibidores de la transcripción y de la traducción: Si se planea la extracción de ARN, para eliminar el riesgo de firmas transcriptómicas asociadas al aislamiento, incluya los inhibidores de la traducción y la transcripción en los pasos del tampón. Prepare el cóctel inhibidor como lo describe Marsh et al. que incluye actinomicina D, anisomicicina y triptólido25.Preparación del inhibidor: Reconstituya las existencias de inhibidores y almacene de la siguiente manera: Reconstituya la actinomicina D en dimetilsulfóxido (DMSO) a 5 mg/ml y almacene a -20 °C. Reconstituir el triptólido en DMSO a 10 mM y conservar a -20 °C, protegido de la luz. Reconstituir la anisociina en DMSO a 10 mg/mL y almacenarla a 4 °C, protegida de la luz. Almacene todas las existencias de inhibidores durante no más de 1 mes después de ser reconstituidas. Modificaciones del tampón: Añadir inhibidores en cuatro tampones diferentes en el protocolo de la siguiente manera: Al realizar la perfusión transcárdica, preparar HBSS con actinomicina D (5 μg/ml, 1:1000 de stock) y triptólido (10 μM, 1:1000 de stock). Después de la perfusión, transportar cerebros al laboratorio en HBSS que contienen actinomicina D (5 μg/mL, 1:1000 de stock), triptolido (10 μM, 1:1000 de stock) y anisomicicina (27,1 μg/mL, 1:368,5 de stock). Preparar tampón FACS con actinomicina D (5 μg/mL, 1:1000 de stock), triptólido (10 μM, 1:1000 de stock) y anisomicicina (27,1 μg/mL, 1:368,5 de stock). Preparar tampón de digestión con actinomicina D (5 μg/mL, 1:1000 de la culata), triptólido (10 μM, 1:1000 de la culata) y anisomicicina (27,1 μg/mL, 1:368,5 de la culata). Prepare el tampón de lavado posterior a la clasificación, con HBSS que contenga actinomicina D (5 μg/ml, 1:1000 de stock), triptólido (10 μM, 1:1000 de stock) y anisocicina (27,1 μg/mL, 1:368,5 de stock).NOTA: Al agregar los inhibidores, asegúrese de agregarlos inmediatamente antes de usarlos y proteja los tampones preparados de la luz mientras está en uso. Evite la congelación y descongelación de las soluciones madre. Lavados posteriores a la clasificación: Debido a que las células se han clasificado en tubos libres de ARNasa de 1,5 ml en tampón FACS, lo que interferirá con el aislamiento del ARN, es necesario lavar las células. Centrifugar las células a 1000 x g a 4 °C durante 5 min y eliminar el sobrenadante, dejando aproximadamente 50 μL de líquido. Añadir 200 μL de 1x HBSS que contenga actinomicina D (5 μg/mL, 1:1000 en stock), triptólido (10 μM, 1:1000 en stock) y anisomicicina (27,1 μg/mL, 1:368,5 en stock) y mezclar bien. Repetir el centrifugado y eliminar el sobrenadante dejando 50 μL de líquido (lavar 1). Añadir 200 μL de tampón de lavado post sort, mezclar bien y repetir el centrifugado y eliminar el sobrenadante dejando 25 μL de líquido (lavar 2). Extracción de ARN: Para el aislamiento de ARN de células microgliales, utilice un kit de aislamiento de ARN de baja entrada para obtener rendimientos de ARN altos y consistentes y puntuaciones de RIN superiores a 9 (consulte a continuación y la Tabla de materiales para obtener recomendaciones de productos). Al gránulo celular, añadir 350 μL del tampón de lisis del kit recomendado + β-mercaptoetanol (1:100) y mezclar bien.NOTA: Si es necesario, el protocolo se puede suspender en este punto. Las muestras pueden almacenarse en el tampón de lisis a -80 °C hasta la extracción del ARN. Si extrae ARN después del almacenamiento, descongele el lisado en hielo y proceda con las instrucciones específicas del kit para el aislamiento. Transfiera el lisado a una trituradora de células en columna (consulte la Tabla de materiales para ver las recomendaciones del producto) y centrifugue a velocidad máxima a 4 °C durante 2 min. Eluir en un mínimo de 14 μL de agua libre de RNasa y determinar la concentración según corresponda. El ARN se puede utilizar para cualquier aplicación posterior después de este punto. Figura 3: Estrategia de compuerta para la ordenación de flujo. Los eventos se limitan al tamaño de celda en SSC-A frente a FSC-H (S1). A continuación, las células se activan para ser singletes en FSC-H frente a FSC-W (S2). Las células singlete se clasifican como vivas si son negativas en Comp-FL8-A::405-526-52 (tinción violeta 525 muerta viva) y como P2RY12+ si son positivas en Comp-FL32-A::640-671_30 (P2RY12-APC) utilizando el control de isotipo P2RY12. Las células se etiquetan como MG y se clasifican tanto si están vivas como si son P2RY12+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. POBLACIÓN CERRADA Frecuencia de los padres Frecuencia de Total Contar S1 68.10% 68.10% 162186 S2>S1 93.59% 63.70% 151707 P2Ry12+ (670+) > S2 > S1 83.05% 52.90% 125986 En vivo (525-) > S2 > S1 92.78% 59.10% 140752 MG (P2RY12+ en vivo) >S2>S1 78.96% 50.30% 119794 Tabla 1: Ejemplo de tabla de linaje de muestra con porcentajes de compuerta y números de eventos esperados. 2. Tinción de flujo intranuclear para el análisis de la expresión de proteínas NOTA: En este punto se pueden iniciar otros tipos de células, este protocolo se prueba con células cultivadas, incluidas las células HEK293, las células similares a la microglía BV2 y la microglía humana derivada de IPSC. Fijación y tinción de célulasNOTA: Para el siguiente protocolo, utilice un kit de tinción intracelular que esté optimizado para la tinción nuclear. Ver Tabla de materiales para recomendaciones de productos.Células teñidas extracelularmente alícuotas de la sección 1.5.2 en una placa de 96 pocillos (5 x 104- 1 x 106 células). Centrifugar las celdas durante 5 min a 500 x g a 4 °C y deslizar para eliminar el tampón FACS.NOTA: Para obtener datos con alta confianza de los niveles medianos, se debe utilizar un mínimo de 10.000 células por pocillo. Si bien no hay un máximo recomendado, es mejor mantener el número de células constante durante todo el experimento para asegurarse de que no haya un efecto significativo de diferentes coeficientes de variación (CV). Fijación y permeabilización: Añadir 200 μL de concentrado 1x fix y mezclar suavemente con la pipeta P200 para resuspender las células. Incubar en la oscuridad durante 45-60 min. Centrifugar la placa durante 5 min a 500 x g a temperatura ambiente (RT) y agitar para desechar el sobrenadante.NOTA: Si es necesario, el protocolo se puede suspender en este punto. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en un tampón de almacenamiento a largo plazo para las células inmunitarias (consulte la Tabla de materiales para conocer las recomendaciones del producto). Las muestras pueden almacenarse a 4 °C durante 12-18 h, protegerse de la luz y cubrirse con una película transparente para proteger la evaporación del tampón. Añadir 200 μL de tampón de permeabilización 1x a cada pocillo y pipetear con un P200 para mezclar. Centrifugar la placa durante 5 min a 500 x g a RT y agitar para desechar el sobrenadante. Repita el lavado del tampón de permeabilización un total de 3 veces. Preparación de los controles de flujo: Divida el volumen de las celdas de cada muestra para los controles de flujo requeridos (10.000-30.000 celdas por pocillo de control es suficiente).Para preparar el control sin tinción, fije las células sin tinción del tipo o las células sin tinción alícuotas en un pocillo separado que no recibirá ningún anticuerpo. Para preparar el control de fluorescencia menos uno (FMO), se deben hacer alícuotas de células para cada uno de los anticuerpos del panel, excepto el de ese canal. En el caso de los canales pertinentes, incluya el anticuerpo de control del isotipo en el FMO para la compuerta. Por ejemplo, en un panel que contiene P2RY12-APC y H3K27Ac-AlexaFluor568, debe haber dos FMOS: (1) el APC-FMO que contiene solo H3K27Ac-AlexaFluor568 y el anticuerpo de control de isotipo P2RY12 y (2) el 568-FMO que contiene solo P2RY12-APC y el primario de control de isotipo y el secundario 568.NOTA: Este protocolo se presenta para probar un solo HPTM, sin embargo, se pueden establecer paneles que contengan muchos HPTM conjugados con diferentes fluoróforos. Tinción de anticuerpos primarios: Añadir 50 μL de tampón de permeabilización 1x con la concentración adecuada de anticuerpo primario a cada pocillo. Incubar durante 30 minutos a RT en la oscuridad. Lavar 2 veces con 200 μL de tampón de permeabilización 1x.NOTA: La concentración de anticuerpos utilizada para cada HPTM se incluye en la Tabla de Materiales. La concentración se determina probando diferentes concentraciones de anticuerpos en células cultivadas tratadas con un estimulante que causaría un aumento dramático, por ejemplo, un inhibidor de HDAC para las marcas de acetilación y asegurándose de que tanto las células tratadas como las no tratadas estuvieran dentro del rango de detección (por encima del control de isotipo y por debajo del rango máximo de detección del citómetro). La concentración óptima de anticuerpos para las HPTM debe tener una mediana media de intensidad fluorescente en el canal de fluoróforos entre 5 x 104 y 1 x 105. Tinción secundaria de anticuerpos: Bloquear con 200 μL de tampón de permeabilización 1x con suero de burro normal (NDS) al 2% durante 10 min en RT. Centrifugar durante 5 min a 500 x g en RT y deslizar para eliminar el sobrenadante. Añadir 50 μL de tampón de permeabilización 1x con NDS al 2% y la concentración adecuada de anticuerpo secundario e incubar durante 30 min a RT en la oscuridad. Agregue 200 μL de tampón de permeabilización 1x a los pocillos para diluir, centrifugue la placa durante 5 min a 500 x g en RT y agite para desechar el sobrenadante. Lavar las celdas 2x con 200 μL de tampón de permeabilización 1x.NOTA: Si es necesario, suspenda el protocolo en este punto. Resuspender las células en 200 μL de tampón de almacenamiento a largo plazo para células inmunitarias con una pipeta P200 (consulte la tabla de materiales para obtener recomendaciones) y almacenar a 4 °C durante 12-24 h protegido de la luz. Preparación para la citometría de flujo: Centrifugar la placa durante 5 min a 500 x g a RT y deslizar para desechar el sobrenadante. Resuspender las células en 200 μL de tampón FACS utilizando una pipeta P200 para citometría de flujo. Sellar con film transparente para su transporte al citómetro. Citometría de flujoPara analizar el panel de anticuerpos propuesto, asegúrese de que el citómetro esté equipado con al menos cuatro láseres, incluidos violeta (405 nm), azul (488 nm), amarillo (561 nm) y rojo (633 nm). El citómetro necesita filtros para detectar FITC (azul-525 nm), KRO (violeta-525 nm), PE (amarillo-585 nm) y APC (rojo-660 nm). Agregue anticuerpos adicionales según el citómetro elegido. Calibración y estandarización: Al comienzo de cada experimento, ejecute perlas fluorescentes arcoíris y ajuste el voltaje del tubo fotomultiplicador (PMT) hasta que los picos de perlas sean comparables a los valores objetivo ejecutados para experimentos anteriores. Este método de estandarización permite acomodar la deriva del equipo a lo largo del tiempo. Compensación: Después de que se haya establecido el voltaje y la ganancia de PMT para el experimento, use perlas de compensación capturadas por anticuerpos para establecer la matriz de compensación para el panel de anticuerpos. Este cálculo asegurará que los fluoróforos no contribuyan a los cambios de señal en otros canales. Esto es cada vez más necesario cuando se multiplexan múltiples anticuerpos. Tamaño de compuerta: En un diagrama de puntos, represente SSC-A en log frente a FSC-H en lineal. Cierre la barrera de residuos y seleccione el tamaño de celda con la puerta S1. Seleccione para celdas singlete en un diagrama de puntos de FSC-W frente a FSC-H y la puerta como S2. (Figura 4). Establecimiento de puertas de fluoróforo: Utilizando el FMO correspondiente para cada canal de fluoróforo, establezca las puertas para determinar qué es una señal positiva en cada canal utilizando histogramas de un solo parámetro (Figura 4). Medición de las muestras: Registre cuidadosamente las muestras utilizando la estrategia de compuerta establecida. Identifique la microglía utilizando la señal P2RY12+, determine la expresión de la proteína en los canales respectivos solo para la microglía. Análisis de datos de citometría de flujoEstablecimiento de puertas de análisis: Siguiendo los pasos anteriores para el citómetro en la interfaz de usuario del software de análisis, utilice las mismas puertas utilizadas para el registro para el análisis. Obtenga los valores de MFI utilizando el software de análisis de citometría de flujo (consulte la Tabla de materiales para obtener recomendaciones): Recapitule la estrategia de activación del citómetro para el análisis de flujo. Con la función de agregar estadísticas, seleccione la mediana para la población de interés (por ejemplo, 568+) en la altura del canal compensado. Con el editor de tablas, exporte los valores medios de intensidad fluorescente (MFI) de los canales respectivos a una hoja de cálculo para continuar con el análisis estadístico (Tabla 2).NOTA: El archivo suplementario S1 incluye datos de ejemplo de ratones inyectados con lipopolisacárido (LPS) y solución salina tamponada con fosfato (PBS) y un archivo de análisis de ejemplo con la estrategia de compuerta y los valores de MFI. Análisis de los valores de MFI para el cambio de pliegue de la proteína: Después de obtener los valores de MFI, calcule el cambio de pliegue de la IMF en relación con la población de control o no tratada (Ecuación 1). El cambio de pliegue de MFI es un reflejo del cambio de pliegue en los niveles de proteínas. Utilizando los valores de cambio de plegamiento, evalúe el cambio en la expresión y calcule la significación estadística mediante una prueba t o ANOVA.Ecuación 1 Figura 4: Estrategia de activación para la evaluación de IMF de proteínas. Los eventos se controlan primero para el tamaño de celda en SSC-A frente a FSC-H (S1). A continuación, las celdas se activan para singletes en FSC-H frente a FSC-W (S2). A continuación, las células singlete se identifican como microglía mediante la señal P2RY12-APC (APC+) y la puerta se establece en función de la fluorescencia en un control APC-FMO que contiene un anticuerpo de control de isotipo. A continuación, las celdas se activan para la señal H3K27Ac-AlexaFluor568 en Comp-FL5-A::Y610-mCherry. La intensidad fluorescente de las 610+ células se determina como un proxy de la expresión de proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.