単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

すべての動物飼育プロトコルは、カナダ動物管理評議会のガイドラインに従って、ブリティッシュコロンビア大学の動物管理委員会によって承認されました。 1. ミクログリア単離のための脳内消化 図1:プロトコルの簡単なフローチャート マウスは最初にHBSSで経心灌流され、脳が解剖されます。その後、脳は化学的消化と機械的破壊によって解離され、単一細胞の均質化になります。免疫濃縮画分は不連続密度勾配によって収集され、その後、細胞はP2RY12について染色されます。染色された細胞は、1)RNA分析または下流タンパク質分析につながる蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)によって選別されるか、2)核内タンパク質の固定、透過処理、染色のいずれかです。タンパク質レベルは、フローサイトメトリーによって決定された目的チャネルの蛍光強度の中央値によって定量されます。青色で着色されたボックスは、プロトコルステップ1)ミクログリア分離のための脳消化の一部です。赤色で着色されたボックスは、プロトコールステップ2)タンパク質発現解析のための核内フロー染色の一部です。BioRender.com で作成。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 試薬の調製注:HPTM解析のためにRNAと細胞の両方を収集する抽出を計画している場合は、転写および翻訳阻害剤を含むように修正する項目について、セクション1.7.1を参照してください。ただし、氷上に保管すると細胞がほとんど静止しているため、タンパク質シグナルを評価するだけの場合は、これは必要ありません。蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファー(サンプルあたり 20 mL):ウシ血清アルブミン(BSA)を 1x Hanks 平衡塩溶液(HBSS)に溶解し、2% BSA 溶液を調製します。EDTAを最終濃度1 mMになるまで2%BSA溶液に溶解します。0.2μmのフィルターでフィルター滅菌し、使用前に4°Cで最大1週間保存してください。 消化バッファー(サンプルあたり 1 mL):パパインバイアルを HBSS で再溶解し、0.5 mM EDTA を含む 1 mM L-システイン中で最終濃度 20 U/mL にします。37°Cで最低10分間、または組織を消化する準備ができるまで活性化します。使用直前に、DNase I を活性化パパイン溶液に添加し、最終濃度を 200 U/mL にします。実験当日に準備し、保管しないでください。 等張密度グラジエント溶液(サンプルあたり 5.5 mL):10 x HBSS を低温密度グラジエント培地に添加し、最終濃度が 1 x HBSS になるようにすると、最終密度は 1.117 g/mL になります。使用前に少なくとも30秒間混合するボルテックス。使用するまで氷の上に置いてください。 37% 密度グラジエント溶液(サンプルあたり 4 mL):1x HBSS に等張密度グラジエントを加えて、最終濃度 37%、最終密度 1.043 g/mL にします。37% 密度グラジエントの mL ごとに 20 μL のフェノールレッドを添加し、レイヤリング中に可視化するためのピンク色の溶液を調製します。使用前に少なくとも30秒間ボルテックスします。使用するまで氷の上に置いてください。 70% 密度グラジエント溶液(サンプルあたり 2 mL):1x HBSS に等張密度グラジエントを加え、最終濃度 70%、最終密度 1.082 g/mL にします。密度70%培地1 mLあたり5 μLのトリパンブルーを添加し、積層中に可視化するためのブルー溶液を調製します。使用前に少なくとも30秒間ボルテックスします。使用するまで氷の上に置いてください。 灌流と脳解剖注:灌流プロトコルは、マウス開胸術、経心灌流、および脳除去のビデオ描写を特徴とするPoselらに似ています21.ここでは、成体のC57BL/6J雄マウスと雌マウス(10-15週齢、20-30g)を使用していますが、このプロトコルはどのマウスでも開胸術を行うことができます。すべての動物実験は、実験を行う前に、施設倫理委員会の承認を受けなければなりません。マウス麻酔:つま先をつまむか、マウスの足をしっかりとつまんだときの反射の欠如で確認できる外科的麻酔の平面を通過するまで、100%酸素中の4%イソフルランでマウスに麻酔をかけます。マウスを仰向けに置き、プラスチックトレイに傾けて置かれた外科用解剖ボードに4本の前足をしっかりと固定し、鼻がイソフルオランのノーズコーンに固定されていることを確認します。移送後、動物がまだ麻酔の手術面を過ぎていることを確認してから、先に進んでください。 マウス胸郭切開術:鉗子を使用して腹部の皮膚をつかんで持ち上げ、皮膚と腹壁を浅く切開して、下行大動脈や下にある臓器に損傷を与えることなく甲状体を露出させます。 鉗子で甲状骨をつかみ、胸郭の下に横方向切開をして横隔膜と肝臓を露出させます。細いハサミを使用して胸郭の長さに沿って横隔膜を慎重に浅く切り込み、組織ハサミを使用して胸郭を貫通し、胸骨をマウスの頭の近くの手術ステーションに固定して、経心灌流のために心臓と肺を露出させます。 経心灌流:蠕動灌流ポンプを準備し、チューブの一端に26.5Gの針を取り付けます。チューブの一端をコールド1x HBSSのバイアルに挿入し、ポンプのスイッチを入れてチューブを1x HBSSで完全に満たすことで、手順のためにチューブをプライミングします。 鈍鉗子で心臓を押さえながら、灌流チューブを取り付けた26.5Gの針先を心臓の左心室に挿入し、右心房を小さく切開します。灌流ポンプをオンにして、少なくとも15〜20 mLの冷たい1x HBSSで2~4 mL/分の速度でマウスを慎重に灌流します。注:完全な灌流は、肝臓が血液をきれいにし始め、心臓と同じ色になったときによく示されます。 脳の除去:組織解剖ハサミを使用してマウスの首を切り落とし、首から鼻までの頭皮を正中線で切開します。皮膚のフラップを横に剥がして頭蓋骨を露出させ、解剖ハサミで頭蓋骨の尾端にある余分な組織と骨を取り除きます。 はさみの片方の刃を頭蓋骨の下に慎重にスライドさせ、鋭い側を骨に向けて大孔に入れ、鼻に向かって正中線を慎重に切り取ります。解剖ハサミを使用して、頭蓋骨の付け根と鼻の近くの両方に横方向の切り込みを入れます。細かい鉗子を使用して、頭蓋骨を正中線から外側に命を吹き込み、頭蓋骨の破片を割って脳を露出させます。へらで脳をそっと持ち上げ、解剖しみ紙の上に置きます。 脳の解剖:氷で満たされた閉じたペトリ皿の上に、1x HBSSで濡らした解剖しみ紙の上に脳を置きます。小脳を取り除き、きれいなカミソリの刃を使用して脳半球を二等分します。 海馬と重なる皮質をそのままに保ちながら、各半球から脳幹、線条体、白質を取り除きます。単離された皮質と海馬組織を含む半球を、5 mLのコールド1x HBSSを含む15 mLチューブに移し、氷上に保管します。注:解剖は、斬首から解剖した組織を氷上の1x HBSSに最終的に配置するまでに2分以内で組織を冷たく保つために、できるだけ早く実行することが重要です。複数の動物からミクログリアを単離する場合、脳を1x HBSSの氷上に~1時間保存してから、動物のコホート全体を消化などの処理に進めることができます。 脳の消化と均質化機械的および化学的解離:各マウスの脳組織と消化バッファー1 mLを氷上の個々のペトリ皿に入れます。清潔なメスの刃を使用して、脳を細かく切り刻みます(<1 mm)。 プラスチック製のトランスファーピペットからチップを切り取り、ミンチにした脳を氷上の24ウェルプレート内の別々のウェルに慎重に移します。プレートを透明なフレキシブルフィルムで覆い、氷上で30分間インキュベートします。注:正しく刻むと、脳組織はよくみじん切りにしたニンニクに似ています。 ダンスホモジナイズ:消化した脳液を各ウェルから、それぞれ 5 mL の冷たい FACS バッファーで満たされた氷上の個々の 7 mL ガラスドンスホモジナイザーに移します。緩い乳棒(A)で各脳を約30〜40回、単一の細胞懸濁液が得られるまで静かに叩きます。Aの杵で2倍にした後、タイトな杵(B)で3〜4回静かに跳ねて、単一細胞の懸濁液を確保します。注意: ホモジナイザーの底にある組織を押しつぶさないように、乳棒を3/4以上押し下げないでください。最終的な解決策は不透明で乳白色でなければなりません。注:1回の実験で複数の脳を消化する場合は、各サンプルが消化バッファーに30分間のみ含まれるように、脳内消化物をFACSバッファーに移すタイミングを計ります。過剰消化は表面タンパク質の切断を引き起こし、下流の抗体結合とシグナルを低下させる可能性があります。 免疫濃縮フラグメントの入手密度勾配の確立:ホモジネートを各脳から別々の 15 mL ポリプロピレンチューブに移し、2.125 mL の等張密度勾配と上部をそれぞれ FACS バッファーで 8.5 mL に加え、最終濃度が 25% の密度勾配を得ます。15mlのチューブを20回静かに反転させて、完全に混ぜます。 細目盛り付きトランスファーピペットを使用して、4 mL の 37% 密度グラジエントを各チューブに静かに下敷きし、清潔な層を確立するように細心の注意を払います。トランスファーピペットを切り替え、2 mL の 70% 密度グラジエントを静かに下敷きにします(図 2A)。4°Cに冷却した遠心分離機に移し、制動ランプをゼロに設定して500 x g で20分間回転させます。 免疫濃縮フラグメントの回収:クリーントランスファーピペットを使用し、クリーントランスファーピペットを使用して、15 mLチューブ内の容量の上部からミエリンを静かに吸引し、廃棄します。トランスファーピペットを使用して、密度グラジエントの上部フラグメントを清潔な 15 mL ポリプロピレンチューブに慎重に集めます。 免疫濃縮フラグメント(70%と37%の密度グラジエント層が合流する位置で上1.5 mL、下1.5 mL)を新しい15 mLポリプロピレンチューブに慎重に集めます(図2B)。免疫濃縮サンプルに 10 mL の FACS バッファーを加えて密度グラジエント培地を希釈し、チューブを 20 回静かに反転させて完全に混合します。注:細胞はチューブの側面に付着する傾向があるため、液体を採取しながらチューブの側面に沿ってピペットをゆっくりと一周させることにより、採取ステップ中にサンプル中のすべての細胞を回収してください。 15 mLのチューブを4°Cの遠心分離機で500 x g で10分間遠心分離し、下り坂のランプブレーキをゼロに設定して、免疫濃縮サンプル中の細胞をペレット化します。スピンが終了したらすぐに、ペレット(見えない場合があります)を乱さないように注意しながら、15 mLチューブに約300 μLの液体を残して、上清を慎重に除去します。 上清を別の 15 mL チューブに集めて、細胞がスピン中でペレット化されたことを確認します(再懸濁ペレットの細胞数で検証したら、この画分を廃棄します)。P1000ピペットを使用して細胞ペレットを300μLの容量で再懸濁した後、血球計算盤で細胞をカウントし、総細胞収量を推定します。 図2:不連続密度勾配による免疫濃縮フラグメントの取得。 (A)脳ホモジネートを25%密度培地に作製し、フェノールレッドを介してピンク色に着色された37%密度培地4mLを下敷きにし、トリパンブルーを介して青色に着色された70%密度培地2mLを下敷きにします。(B)遠心分離後、フラクションが分離した。ミクログリアは、37%および70%密度の培地断片の界面にあります。ミエリン断片は 15 mL チューブの上部にあり、廃棄されます。一番上のフラグメントは、スピンが失敗した場合に備えてバックアップとして収集され、細胞は回収されません。その場合は、この分数を使用して勾配を繰り返すことができます。免疫濃縮画分は下流で回収されます。赤血球を含む下部画分はチューブ内に残り、廃棄されます。(C)完全なレイヤーを描いた図の例。BioRender.com で作成。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 細胞外抗体染色ブロッキング:氷上の丸底96ウェルプレートに細胞を移し、ブレーキ付きで500 x g で遠心分離して細胞をペレット化します。プレートをはじいて上澄みを処分し、細胞ペレットをウェルの底にそのまま残して、シンク内の上澄みをすばやく取り除きます。 P200ピペット(最終濃度10 μg/mL、希釈係数1:50)を用いて、抗マウスCD16/32 FC-Receptorブロッキング試薬を含む50 μLのFACSバッファーに細胞を再懸濁し、単球または他のFcR担持細胞への抗体の非特異的結合を防ぎます。氷上で10分間インキュベートします。 抗体染色:P2RY12-アロフィコシアニン(APC;希釈係数1:50、濃度4 μg/mL、最終ウェル濃度1:100、濃度2 μg/mL)およびBiolet 525ライブデッド染色(希釈係数1:50、最終ウェル濃度1:100)を含む2倍マスターミックスを適切な容量で調製します。50 μLの染色マスターミックスを細胞懸濁液(セクション1.5.1でブロッキングした後に得られたもの)に加え、氷上で暗所でプレートを30分間インキュベートします。注:このプロトコルでは、P2RY12でセルを染色することを提示します。第一に、P2RY12はミクログリアの恒常性マーカーであり、特定の疾患状況でダウンレギュレーションすることができます。例えば、5XFADアルツハイマー病モデルマウスはP2RY12レベルをダウンレギュレートしており、22の同定が困難になる可能性がある。単離に使用できる代替染色剤には、Tmem119、Cd11b、およびCD4523が含まれます。第二に、コンジュゲート蛍光色素APCは、目的の抗体パネルに合わせて調整できます。ただし、APCやPEなどの明るい蛍光色素を選択すると、陽性と陰性の母集団を簡単に区別できるようになります24。 染色後、200 μLのFACSバッファーを各ウェルに直接添加して細胞を洗浄します。4°Cで500 x g でスピンし、フリックして上清を除去します。P200ピペットで200 μLのFACSバッファーに細胞を再懸濁し、4°Cで500 x g でスピンし、プレートをフリックしてウェルからバッファーを除去します。 フローコントロールの準備:染色する前に、ステップ1.5.1でブロッキングした後、必要な量の細胞を各サンプルから分離し、必要なフローコントロールを行います。注:ゲートを確立するには、各実験にフロー制御が必要です。流量制御は、追加の動物から、または各実験ウェルの一部から採取できます。高い信頼性でゲートを確立するには、コントロールごとに 10,000 から 30,000 個のセルが必要であるため、セルを分割する場合は、コントロールごとに十分なセルを割り当てるようにしてください。関連するフローコントロールには、染色なし、生死、P2RY12アイソタイプコントロールの3つがあります。無防汚化のためには、抗体を添加しないでください。P2RY12アイソタイプコントロールでは、細胞を生存色素(1:100)とAPCに結合したアイソタイプコントロール抗体(1:100)で処理します。 生デッドコントロールを調製するには、細胞を別のウェルに分注し、細胞容量の半分を 500 μL のチューブに移します。500μLのチューブを-80°Cの冷凍庫に5分間入れた後、37°Cのインキュベーターに5分間入れて細胞を死滅させます。死細胞のアリコートを生デッドコントロールウェルに戻し、バイオレット525(希釈係数1:100)のアミン結合生存率色素で染色して、死細胞をマークします。注:このプロトコールは、上清除去のためのフリック法によるプレート染色用に書かれています。ただし、これには、スピンが完了した直後に上澄み液を除去する必要があり、フリックは、ペレットを乱すことなく上清をすばやく除去するのに十分な力で行う必要があります。あるいは、1.5 mLのRNAse/DNaseフリーチューブを染色に使用し、以下の変更を加えて染色することもできます。 細胞を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、800 x g で4°Cで5分間ペレット化します。 ピペットで上清を吸引します。ヒント:スピードを上げるために、P200チップを備えた5 mLトランスファーピペットを使用すると、上清を迅速かつ正確に吸引できます。吸引するときは、ペレットを確認してください。ペレットが見えない場合は、50 μLの上清を残し、それに応じて計算を調整してください。抗体を洗い流すときは、FACSを追加して抗体の希釈率を上げ(200 μLではなく1000 μL)、上清の不完全な除去を考慮してください。サイトメーターによっては、1.5 mLチューブをソーティングに使用することで、必要な供給量を減らすことができます。 ミクログリアのFACS選別調製:各ウェルをP200ピペットで200 μLのFACSバッファーに再懸濁し、標識付きフローソートチューブに移し、FACSバッファーを合計500 μLに添加して、1 mLあたり約5 x 105 イベントの濃度にします。分析まで暗所で氷上に保管してください。1.5 mL RNAseフリーチューブに細胞のクッションとして100 μLのFACSバッファーを添加して、ポストソーティングチューブを調製します。 サイトメーターの設定:100 μmのノズルでセットアップしたフローサイトメトリーセルソーターで細胞をソーティングします。18〜20psiを使用してセルを並べ替えます。 ゲーティング:サイトメーターでは、サイドスキャッター(SSC)面積と前方散乱(FSC)高さを使用して細胞サイズをゲートし、デブリを区別するために無染色コントロールを使用し、SSC-Aを対数軸上に置いて細胞集団を可視化し、細胞を厳密に選択するようにゲートします(ゲートS1; 図3)。ダブレットを除去するには、FSC-HとFSC-Wをプロットし、細胞集団の周囲に密接なゲートを形成し、破片やダブレットを除去します(ゲートS2)。P2RY12アイソタイプコントロールを使用して、APCチャンネルの細胞を検査し、自家蛍光のゲートを設定してP2RY12+細胞を決定します。無染色および生死コントロールを使用して、525 nm紫色で蛍光を発しない細胞を生細胞としてゲートします。 ソート:紫色525 nmとAPCをプロットし、P2RY12+でFMO(MG)によって生きている集団を決定します。これらの細胞をラベル付きのポストソートチューブにソートします(図3)。最終的なソート率は、イベント全体の約50%であり、イベント全体の損失の大部分はゲートS1で除去された破片です(~70%のイベントはセルです。 表1)。 RNAの単離と分析転写および翻訳阻害剤:RNA抽出を計画する場合、関連するトランスクリプトームシグネチャーを単離するリスクを排除するために、翻訳および転写の阻害剤をバッファーステップに含めます。アクチノマイシンD、アニソマイシンおよびトリプトリドを含むMarshらによって記述されたインヒビターカクテルを調製する25。阻害剤の調製:阻害剤ストックを再構成し、以下のように保存します:ジメチルスルホキシド(DMSO)中のアクチノマイシンDを5 mg/mLに再溶解し、-20°Cで保存します。 トリプトリドをDMSOで10 mMに再溶解し、-20°Cで光から保護して保存します。アニソマイシンをDMSOで10 mg/mLに再溶解し、光から保護して4°Cで保存します。すべての阻害剤ストックは、再構成後1か月以内に保管してください。. バッファーの修飾: プロトコルの 4 つの異なるバッファーに阻害剤を次のように添加します。 経心灌流を行う場合は、アクチノマイシン D (5 μg/mL、ストックから 1:1000) およびトリプトリド (10 μM、ストックから 1:1000) で HBSS を調製します。灌流後、アクチノマイシンD(5 μg/mL、ストックから1:1000)、トリプトライド(10 μM、ストックから1:1000)、アニソマイシン(27.1 μg/mL、ストックから1:368.5)を含むHBSSで脳をラボに輸送します。アクチノマイシンD(5 μg/mL、ストックから1:1000)、トリプトリド(10 μM、ストックから1:1000)、アニソマイシン(27.1 μg/mL、ストックから1:368.5)でFACSバッファーを調製します。アクチノマイシンD(5 μg/mL、ストックから1:1000)、トリプトリド(10 μM、ストックから1:1000)、アニソマイシン(27.1 μg/mL、ストックから1:368.5)で消化バッファーを調製します。アクチノマイシンD(5 μg/mL、ストックから1:1000)、トリプトリド(10 μM、ストックから1:1000)、アニソマイシン(27.1 μg/mL、ストックから1:368.5)を含むHBSSを使用して、ソート後の洗浄バッファーを調製します。注意:阻害剤を添加する場合は、使用直前に添加し、調製したバッファーを使用中に光から保護してください。原液の凍結融解は避けてください。 ソーティング後の洗浄:細胞はFACSバッファー中の1.5 mLのRNaseフリーチューブにソーティングされており、RNAの単離を妨げるため、細胞を洗浄する必要があります。細胞を1000 x g 、4°C、5分間スピンし、上清を除去し、約50 μLの液体を残します。 アクチノマイシンD(5 μg/mL、ストックから1:1000)、トリプトリド(10 μM、ストックから1:1000)、アニソマイシン(27.1 μg/mL、ストックから1:368.5)を含む1x HBSSを200 μL添加し、完全に混合します。スピンを繰り返し、50 μLの液体を残して上清を除去します(洗浄1)。200 μL のポストソート洗浄バッファーを加え、十分に混合してスピンを繰り返し、上清を除去し、25 μL の液体を残します(洗浄 2)。 RNA抽出:ミクログリア細胞からのRNA単離には、低インプットRNA単離キットを使用して、RNA収量が高く、RINスコアが9を超えます(推奨製品については、以下および 資料表 を参照)。細胞ペレットに、推奨キット+β-メルカプトエタノール(1:100)の溶解緩衝液350 μLを加え、よく混合します。注: 必要に応じて、この時点でプロトコルを一時停止できます。サンプルは、RNA抽出まで-80°Cの溶解バッファーに保存できます。保存後にRNAを抽出する場合は、ライセートを氷上で融解し、キット固有の単離手順に進んでください。 ライセートをカラムベースの細胞シュレッダー(推奨製品については 材料表 を参照)に移し、最高速度で4°Cで2分間遠心分離します。最低14 μLのRNaseフリー水に溶出し、必要に応じて濃度を決定します。RNAは、この時点以降、あらゆるダウンストリームアプリケーションに使用できます。 図3:フローソートのゲーティング戦略 イベントは、SSC-A と FSC-H (S1) のセル サイズに対してゲートされます。次に、細胞をFSC-HとFSC-W(S2)で一重項になるようにゲーティングします。一重項細胞は、P2RY12-アイソタイプコントロールを用いて、Comp-FL8-A::405-526-52(バイオレット525生死染色)で陰性の場合は生細胞として、Comp-FL32-A::640-671_30(P2RY12-APC)で陽性の場合はP2RY12+としてソートされます。細胞はMGとして標識され、生細胞とP2RY12+の両方がソートされます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 ゲーテッド・ポピュレーション 親の頻度 合計の頻度 数える S1の 68.10% 68.10% 162186 S2>S1の 93.59% 63.70% 151707 P2Ry12+ (670+) > S2 > S1 83.05% 52.90% 125986 ライブ (525-) > S2 > S1 92.78% 59.10% 140752 MG(P2RY12+ライブ)>S2>S1 78.96% 50.30% 119794 表1: ゲーティング率と予想されるイベント数を含むサンプル系列テーブルの例。 2. 蛋白質発現解析のための核内流動染色 注:他の細胞タイプはこの時点で開始することができ、このプロトコルはHEK293細胞、BV2ミクログリア様細胞、およびヒトIPSC由来ミクログリアを含む培養細胞でテストされます。 細胞の固定と染色注:以下のプロトコルでは、核染色に最適化された細胞内染色キットを使用してください。見る 材料表 製品の推奨事項について。セクション1.5.2の細胞外染色した細胞を96ウェルプレート(5 x 104- 1 x 106 細胞)に分注します。細胞を4°C、500 x g で5分間スピンし、フリックしてFACSバッファーを除去します。注:中央値レベルの信頼度の高いデータを得るには、ウェルあたり最低 10,000 個の細胞を使用する必要があります。推奨される最大値はありませんが、異なる変動係数(CV)による有意な影響がないように、実験全体を通して細胞数を一定に保つのが最善です。 固定および透過処理:200 μL の 1x 固定濃縮液を加え、P200 ピペットで穏やかに混合して細胞を再懸濁します。暗所で45〜60分間インキュベートします。 プレートを室温(RT)で500 x g で5分間遠心分離し、フリックして上清を廃棄します。注: 必要に応じて、この時点でプロトコルを一時停止できます。上清を廃棄した後、免疫細胞の長期保存バッファーに細胞を再懸濁します(推奨製品については 、材料表 を参照)。サンプルは4°Cで12〜18時間保存でき、光から保護され、透明フィルムで覆われて緩衝液の蒸発を保護します。 200 μL の 1x 透過処理バッファーを各ウェルに加え、P200 でピペットして混合します。室温で500 x gでプレートを5分間遠心分離し、フリックして上清を廃棄します。透過処理バッファーの洗浄を合計3回繰り返します。 フローコントロールの準備:必要なフローコントロールのために、各サンプルから細胞の体積を分割します(コントロールウェルあたり10,000〜30,000個の細胞で十分です)。無染色コントロールを調製するには、未染色細胞のソートまたは分注から無染色細胞を、抗体を受け取らない別のウェルに固定します。 蛍光マイナス1(FMO)コントロールを調製するには、そのチャンネルの抗体を除くパネル上の各抗体について細胞を分注します。 関連するチャネルについては、アイソタイプコントロール抗体をゲーティング用のFMOに含めます。例えば、P2RY12-APCとH3K27Ac-AlexaFluor568を含むパネルでは、(1)H3K27Ac-AlexaFluor568とP2RY12アイソタイプコントロール抗体のみを含むAPC-FMOと、(2)P2RY12-APCとアイソタイプコントロールプライマリーおよび568セカンダリーのみを含む568-FMOの2つのFMOが存在する必要があります。注:このプロトコールは、単一のHPTMを試験するために提示されていますが、異なる蛍光色素に結合した多数のHPTMを含むパネルを確立することができます。 一次抗体染色:適切な濃度の一次抗体を含む 1x 透過化バッファー 50 μL を各ウェルに加えます。暗闇のRTで30分間インキュベートします。200 μL の 1x 透過処理バッファーで 2 回洗浄します。注:各HPTMに使用した抗体の濃度は、 材料表に記載されています。濃度は、アセチル化マークのHDAC阻害剤など、劇的な増加を引き起こす刺激剤で処理された培養細胞でさまざまな濃度の抗体をテストし、未処理細胞と処理済み細胞の両方が検出範囲内(アイソタイプコントロールを超え、サイトメーターの最大検出範囲未満)に十分収まっていることを確認することによって決定されます。HPTMの最適な抗体濃度は、蛍光色素チャネルの平均蛍光強度の中央値が5 x 104 から1 x 105の間である必要があります。 二次抗体染色:200 μL の 1x 透過処理バッファーと 2% 正常ロバ血清(NDS)で 10 分間室温でブロックし、室温で 500 x g で 5 分間回転させ、フリックして上清を除去します。 2% NDSと適切な濃度の二次抗体を含む1x透過処理バッファー50 μLを加え、暗所の室温で30分間インキュベートします。200 μL の 1x 透過処理バッファーをウェルに添加して希釈し、プレートを室温で 500 x g で 5 分間遠心分離し、フリックして上清を廃棄します。200 μL の 1x 透過処理バッファーで細胞を 2 回洗浄します。メモ: 必要に応じて、この時点でプロトコルを一時停止します。P200ピペット(推奨については 材料表 を参照)で免疫細胞用の長期保存バッファー200 μLに細胞を再懸濁し、光から保護して4°Cで12〜24時間保存します。 フローサイトメトリーの準備:プレートを室温で500 x g で5分間遠心分離し、フリックして上清を廃棄します。フローサイトメトリー用のP200ピペットを使用して、200 μLのFACSバッファーに細胞を再懸濁します。サイトメーターに輸送するための透明フィルムで密封します。 フローサイトメトリー提案された抗体パネルを分析するには、サイトメーターにバイオレット(405 nm)、ブルー(488 nm)、イエロー(561 nm)、レッド(633 nm)の少なくとも4つのレーザーが装備されていることを確認してください。サイトメーターには、FITC(青-525 nm)、KRO(紫-525 nm)、PE(黄-585 nm)、APC(赤-660 nm)を検出するためのフィルターが必要です。選択したサイトメーターに応じて抗体を追加します。 キャリブレーションと標準化:各実験の開始時に、レインボー蛍光ビーズを泳動し、ビーズのピークが以前の実験で実行した目標値に匹敵するまで光電子増倍管(PMT)電圧を調整します。この標準化方法により、時間の経過に伴う機器のドリフトに対応できます。 補正:実験用にPMT電圧とゲインを設定した後、抗体捕捉補正ビーズを使用して、抗体パネルの補正マトリックスを確立します。この計算により、蛍光色素が他のチャンネルのシグナル変化に寄与していないことを確認できます。これは、複数の抗体をマルチプレックス化する際にますます必要になります。 サイズゲーティング:ドットプロットで、SSC-Aを対数にプロットし、FSC-Hを線形にプロットします。デブリをゲートアウトし、S1ゲートを使用してセルサイズを選択します。FSC-WとFSC-Hのドットプロットでシングレットセルを選択し、ゲートをS2として選択します。(図4)。 蛍光色素ゲートの確立:各蛍光色素チャンネルに関連する FMO を使用してゲートを確立し、単一パラメーターのヒストグラムを使用して各チャンネルの正のシグナルを決定します(図 4)。 サンプルの測定:確立されたゲーティング戦略を使用してサンプルを慎重に記録します。P2RY12+シグナルを用いてミクログリアを同定し、ミクログリアのみのそれぞれのチャネルにおけるタンパク質の発現を決定します。 フローサイトメトリーデータ解析解析ゲートの確立:解析ソフトウェアのユーザーインターフェースでサイトメーターに上記の手順を使用し、解析用の記録に使用したのと同じゲートを使用します。 フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してMFI値を取得します(推奨事項については 、資料表 を参照)。 フロー解析のためのサイトメーターゲーティング戦略を要約します。統計の追加機能を使用して、補正されたチャネルの高さで関心のある母集団の中央値(例:568+)を選択します。テーブルエディターを使用して、各チャンネルの蛍光強度(MFI)の中央値をスプレッドシートにエクスポートし、統計解析を進めます(表2)。注: 補足ファイルS1 には、リポ多糖(LPS)およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)注入マウスのサンプルデータと、ゲーティング戦略とMFI値を含むサンプル分析ファイルが含まれています。 タンパク質の倍数変化に対するMFI値の分析:MFI値を取得した後、対照または未処理の集団に対するMFIの倍数変化を計算します(式1)。MFIの倍数変化は、タンパク質レベルの倍率の変化を反映しています。倍率変化値を使用して、発現の変化を評価し、t検定または分散分析を使用して統計的有意性を計算します。数式 1 図4:タンパク質MFI評価のためのゲーティング戦略。 イベントは、SSC-A と FSC-H (S1) のセル サイズに対して最初にゲートされます。次に、FSC-H と FSC-W(S2)のシングレットについて、細胞をゲーティングします。次に、一重項細胞は、アイソタイプコントロール抗体を含むAPC-FMOコントロールの蛍光に基づいてゲートが確立されたP2RY12-APCシグナル(APC+)によってミクログリアとして識別されます。次に、細胞はComp-FL5-A::Y610-mCherry上のH3K27Ac-AlexaFluor568シグナルに対してゲーティングされます。610+細胞の蛍光強度は、タンパク質発現のプロキシとして決定されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。