Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

Alle Tierpflegeprotokolle wurden vom Animal Care Committee der University of British Columbia in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care genehmigt. 1. Gehirnverdauung zur Isolierung von Mikroglia Abbildung 1: Einfaches Flussdiagramm des Protokolls. Die Mäuse werden zunächst transkardial mit HBSS perfundiert und das Gehirn präpariert. Das Gehirn wird dann durch chemischen Verdau und mechanischen Aufschluss dissoziiert, um ein einzelnes Zellhomogenat zu erhalten. Die immunangereicherte Fraktion wird über einen diskontinuierlichen Dichtegradienten gesammelt, woraufhin die Zellen für P2RY12 gefärbt werden. Die gefärbten Zellen werden entweder 1) mittels fluoreszierender aktivierter Zellsortierung (FACS) sortiert, um zur RNA-Analyse oder zur nachgeschalteten Proteinanalyse zu führen, und/oder 2) fixiert, permeabilisiert und für intranukleäre Proteine gefärbt. Der Proteingehalt wird durch die mediane Fluoreszenzintensität in dem durch Durchflusszytometrie bestimmten Kanal von Interesse quantifiziert. Blau gefärbte Kästchen sind Teil des Protokollschritts 1) Gehirnverdauung zur Isolierung von Mikroglia. Rot markierte Kästchen sind Teil des Protokollschritts 2) Intranukleäre Durchflussfärbung für die Proteinexpressionsanalyse. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Herstellung von ReagenzienHINWEIS: Wenn Sie eine Extraktion planen, um sowohl RNA als auch Zellen für die HPTM-Analyse zu sammeln, lesen Sie Abschnitt 1.7.1 für Modifikationen, um Transkriptions- und Translationsinhibitoren einzubeziehen. Dies ist jedoch nicht erforderlich, wenn nur das Proteinsignal bewertet wird, da die Zellen weitgehend ruhen, wenn sie auf Eis gehalten werden.FACS-Puffer (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung) (20 ml pro Probe): Rinderserumalbumin (BSA) in 1x Hanks-Salzlösung (HBSS) auflösen, um eine 2%ige BSA-Lösung herzustellen. EDTA wird bis zu einer Endkonzentration von 1 mM in der 2%igen BSA-Lösung gelöst. Filter mit einem 0,2-μm-Filter sterilisieren und vor der Verwendung bis zu 1 Woche bei 4 °C lagern. Aufschlusspuffer (1 ml pro Probe): Rekonstituieren Sie eine Durchstechflasche mit Papain in HBSS auf eine Endkonzentration von 20 U/ml in 1 mM L-Cystein mit 0,5 mM EDTA. Bei 37 °C für mindestens 10 Minuten aktivieren oder bis das Gewebe verdaut werden kann. Kurz vor der Anwendung wird DNase I bis zu einer Endkonzentration von 200 U/ml in die aktivierte Papainlösung gegeben. Bereiten Sie diese am Tag des Experiments vor und lagern Sie sie nicht. Isotonische Dichtegradientenlösung (5,5 ml pro Probe): 10x HBSS in kaltes Dichtegradientenmedium bis zu einer Endkonzentration von 1x HBSS zugeben, was zu einer Enddichte von 1,117 g/ml führt. Vor Gebrauch mindestens 30 s lang mischen. Bis zur Verwendung auf Eis legen. 37%ige Dichtegradientenlösung (4 ml pro Probe): Fügen Sie 1x HBSS einen isotonischen Dichtegradienten hinzu, um eine Endkonzentration von 37 % mit einer Enddichte von 1,043 g/ml zu erhalten. Fügen Sie 20 μl Phenolrot für jeden ml mit einem Dichtegradienten von 37 % hinzu, um eine rosafarbene Lösung für die Visualisierung während des Schichtens herzustellen. Vor Gebrauch mindestens 30 s vortexen. Bis zur Verwendung auf Eis legen. 70%ige Dichtegradientenlösung (2 ml pro Probe): Fügen Sie 1x HBSS einen isotonischen Dichtegradienten hinzu, um eine Endkonzentration von 70 % mit einer Enddichte von 1,082 g/ml zu erhalten. Fügen Sie 5 μl Trypanblau für jeden ml eines Mediums mit 70%iger Dichte hinzu, um eine blaue Lösung für die Visualisierung während des Schichtens herzustellen. Vor Gebrauch mindestens 30 s vortexen. Bis zur Verwendung auf Eis legen. Perfusion und HirndissektionHINWEIS: Das Perfusionsprotokoll ähnelt dem von Posel et al., das eine Videodarstellung der Thorakotomie, der transkardialen Perfusion und der Gehirnentfernung der Maus enthält21. Hier verwenden wir adulte männliche und weibliche C57BL/6J-Mäuse (10-15 Wochen alt, 20-30 g), aber dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Thorakotomie für jede Maus durchzuführen. Alle tierexperimentellen Eingriffe müssen vor der Durchführung von Experimenten von der institutionellen Ethikkommission genehmigt werden.Anästhesie der Maus: Betäuben Sie Mäuse mit 4 % Isofluran in 100 % Sauerstoff bis über die Ebene der chirurgischen Anästhesie, die durch ein Einklemmen der Zehen oder einen fehlenden Reflex beim festen Einklemmen des Mausfußes bestätigt werden kann. Legen Sie die Maus auf den Rücken und stecken Sie ihre vier Pfoten fest in das chirurgische Sezierbrett, das sich gekippt in einer Kunststoffschale befindet, um sicherzustellen, dass die Nase im Isofluoran-Nasenkonus befestigt ist. Stellen Sie nach dem Transfer sicher, dass sich das Tier noch hinter der chirurgischen Anästhesieebene befindet, bevor Sie fortfahren. Maus-Thorakotomie: Greifen und heben Sie die Bauchhaut mit einer Zange an und machen Sie einen flachen Schnitt durch die Haut und die Bauchdecke, um das Xyphoid freizulegen, ohne die absteigende Aorta oder darunter liegende Organe zu beschädigen. Greife das Xyphoid mit einer Pinzette und mache seitliche Schnitte unter dem Brustkorb, um das Zwerchfell und die Leber freizulegen. Machen Sie vorsichtige, flache Schnitte durch das Zwerchfell entlang der Länge des Brustkorbs mit einer feinen Schere und durch den Brustkorb mit einer Gewebeschere und stecken Sie das Brustbein an der chirurgischen Station in der Nähe des Kopfes der Maus fest, um das Herz und die Lunge für die transkardiale Perfusion freizulegen. Transkardiale Perfusion: Bereiten Sie eine peristaltische Perfusionspumpe vor und befestigen Sie eine 26,5-G-Nadel an einem Ende des Schlauchs. Bereiten Sie den Schlauch für den Eingriff vor, indem Sie ein Ende des Schlauchs in ein Fläschchen mit kaltem 1x HBSS einführen und die Pumpe einschalten, um den Schlauch vollständig mit 1x HBSS zu füllen. Während Sie das Herz mit einer stumpfen Zange halten, führen Sie die Spitze einer 26,5G-Nadel mit dem daran befestigten Perfusionsschlauch in die linke Herzkammer ein und machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof. Schalten Sie die Perfusionspumpe ein, um die Maus vorsichtig mit einer Rate von ~2-4 ml/min mit mindestens 15-20 ml kaltem 1x HBSS zu perfundieren.HINWEIS: Eine vollständige Perfusion ist oft angezeigt, wenn die Leber beginnt, Blut zu klären und die gleiche Farbe wie das Herz annimmt. Gehirnentfernung: Enthaupten Sie die Maus mit einer Gewebepräparierschere und machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Kopfhaut vom Hals bis zur Nase. Schälen Sie die Hautlappen zu den Seiten, um den Schädel freizulegen, und entfernen Sie überschüssiges Gewebe und Knochen am kaudalen Ende des Schädels mit einer Präparierscheibe. Schieben Sie vorsichtig eine Klinge der Schere unter den Schädel in das Foramen magnum, wobei die scharfe Seite zum Knochen zeigt, und schneiden Sie vorsichtig die Mittellinie zur Nase hin auf. Mache seitliche Schnitte sowohl an der Schädelbasis als auch in der Nähe der Nase mit einer Präparierschere. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um den Schädel von der Mittellinie nach außen zu führen, um die Schädelteile abzubrechen und das Gehirn freizulegen. Heben Sie das Gehirn vorsichtig mit einem Spatel an und legen Sie es auf Sezierkleckspapier. Gehirndissektion: Legen Sie das Gehirn auf ein mit 1x HBSS benetztes Stück Präparierpapier auf eine geschlossene, mit Eis gefüllte Petrischale. Entferne das Kleinhirn und halbiere die Gehirnhälften mit einer sauberen Rasierklinge. Entfernen Sie den Hirnstamm, das Striatum und die weiße Substanz aus jeder Hemisphäre, während der Hippocampus und der überlagernde Kortex intakt bleiben. Die Hemisphären, die isoliertes Kortex- und Hippocampusgewebe enthalten, in ein 15-ml-Röhrchen mit 5 ml kaltem 1x HBSS überführen und auf Eis lassen.HINWEIS: Es ist wichtig, die Dissektionen so schnell wie möglich durchzuführen, damit das Gewebe kalt bleibt, mit nicht mehr als 2 Minuten zwischen der Enthauptung und dem endgültigen Einsetzen des präparierten Gewebes in 1x HBSS auf Eis. Wenn die Mikroglia von mehreren Tieren isoliert werden, können die Gehirne ~1 h lang in 1x HBSS auf Eis gelagert werden, bevor mit der Verarbeitung der gesamten Kohorte von Tieren für die Verdauung usw. fortgefahren wird. Verdauung und Homogenisierung des GehirnsMechanische und chemische Dissoziation: Geben Sie das Hirngewebe jeder Maus und 1 ml Verdauungspuffer in einzelne Petrischalen auf Eis. Zerhacken Sie das Gehirn mit einer sauberen Skalpellklinge gründlich in kleine Stücke (<1 mm). Schneiden Sie die Spitze einer Plastik-Transferpipette ab und geben Sie jedes der gehackten Gehirne vorsichtig in separate Vertiefungen innerhalb einer 24-Well-Platte auf Eis. Die Platte mit transparenter Weichfolie abdecken und 30 Minuten auf Eis inkubieren.HINWEIS: Wenn es richtig gehackt wird, ähnelt das Gehirngewebe gut gehacktem Knoblauch. Dounce-Homogenisierung: Übertragen Sie die verdaute Gehirnlösung aus jedem Well in einzelne 7-ml-Glas-Dounce-Homogenisatoren auf Eis, die jeweils mit 5 ml kaltem FACS-Puffer gefüllt sind. Tupfen Sie jedes Gehirn vorsichtig mit dem losen Stößel (A), etwa 30-40 Mal, bis eine einzelne Zellsuspension erhalten ist. Nachdem Sie mit dem A-Stößel geklopft haben, klopfen Sie vorsichtig mit dem festen Stößel (B) 3-4 Mal, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.HINWEIS: Drücken Sie den Stößel nicht mehr als 3/4 des Weges nach unten, um zu vermeiden, dass das Gewebe am Boden des Homogenisators zerquetscht wird. Die endgültige Lösung sollte undurchsichtig und milchig sein.HINWEIS: Wenn Sie mehrere Gehirne in einem einzigen Experiment verdauen, planen Sie den Transfer des Gehirnverdaus in den FACS-Puffer so, dass sich jede Probe nur 30 Minuten lang im Aufschlusspuffer befindet. Eine Überverdauung kann zu einer Spaltung von Oberflächenproteinen führen, wodurch die nachgeschaltete Antikörperbindung und das Signal reduziert werden. Gewinnung eines immunangereicherten FragmentsEtablierung des Dichtegradienten: Übertragen Sie das Homogenat aus jedem Gehirn in separate 15-ml-Polypropylenröhrchen und fügen Sie 2,125 ml isotonischen Dichtegradienten hinzu und geben Sie 8,5 ml mit FACS-Puffer für jedes auf, um eine Endkonzentration von 25 % Dichtegradient zu erhalten. Drehen Sie die 15-ml-Röhrchen vorsichtig 20x um, um sie gründlich zu mischen. Tragen Sie mit einer schmal abgestuften Transferpipette vorsichtig 4 ml mit einem Dichtegradienten von 37 % in jedes Röhrchen ein, wobei Sie sehr darauf achten müssen, saubere Schichten zu schaffen. Wechseln Sie die Transferpipetten und unterlegen Sie vorsichtig 2 ml mit einem Dichtegradienten von 70 % (Abbildung 2A). In eine auf 4 °C abgekühlte Zentrifuge überführen und 20 min lang bei 500 x g schleudern, wobei die Bremsrampe auf Null gestellt ist. Sammeln von immunangereicherten Fragmenten: Mit sauberen Transferpipetten das Myelin vorsichtig von der Oberseite des Volumens im 15-ml-Röhrchen mit einer sauberen Transferpipette absaugen und verwerfen. Das obere Fragment des Dichtegradienten wird vorsichtig mit einer Transferpipette in ein sauberes 15-ml-Polypropylenröhrchen aufgefangen. Das immunangereicherte Fragment (1,5 ml oberhalb und 1,5 ml unterhalb der Stelle, an der die 70%igen und 37%igen Dichtegradientenschichten aufeinandertreffen) wird vorsichtig in ein neues 15-ml-Polypropylenröhrchen aufgefangen (Abbildung 2B). Geben Sie 10 ml FACS-Puffer in die immunangereicherte Probe, um das Dichtegradientenmedium zu verdünnen, und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig 20x um, um es gründlich zu mischen.HINWEIS: Da Zellen dazu neigen, an den Seiten des Röhrchens zu kleben, stellen Sie sicher, dass alle Zellen in der Probe während der Entnahmeschritte gesammelt werden, indem Sie die Pipette langsam an den Seiten des Röhrchens kreisen, während Sie die Flüssigkeit auffangen. Die Zellen in der immunangereicherten Probe werden pelletiert, indem die 15-ml-Röhrchen in einer 4 °C-Zentrifuge bei 500 x g 10 Minuten lang zentrifugiert werden, wobei die Downhill-Rampenbremse auf Null eingestellt ist. Entfernen Sie den Überstand sofort nach Beendigung des Schleuderns vorsichtig und lassen Sie ca. 300 μl Flüssigkeit im 15-ml-Röhrchen, wobei Sie darauf achten müssen, das Pellet nicht zu stören (das möglicherweise nicht sichtbar ist). Sammeln Sie den Überstand in einem weiteren 15-ml-Röhrchen, um sicherzustellen, dass die Zellen im Spin pelletiert wurden (verwerfen Sie diese Fraktion, sobald die Überprüfung mit der Zellzahl des resuspendierten Pellets abgeschlossen ist). Nach der Resuspension des Zellpellets im 300-μl-Volumen mit einer P1000-Pipette werden die Zellen mit einem Hämazytometer gezählt, um die Gesamtzellausbeute abzuschätzen. Abbildung 2: Gewinnung des immunangereicherten Fragments durch diskontinuierlichen Dichtegradienten. (A) Das Gehirnhomogenat wird zu 25 % Dichtemedium hergestellt, 4 ml mit 37 % Dichte mittelrosa über Phenolrot und 2 ml mit 70 % Dichte mittelblau über Trypanblau unterlegt. (B) Nach der Zentrifugation haben sich die Fraktionen getrennt. Mikroglia ruhen an der Grenzfläche von Medienfragmenten mit einer Dichte von 37 % und 70 %. Das Myelinfragment befindet sich an der Oberseite des 15-ml-Röhrchens und wird verworfen. Das oberste Fragment wird als Backup gesammelt, falls der Spin fehlschlägt und keine Zellen geborgen werden. In diesem Fall kann der Gradient mit diesem Bruch wiederholt werden. Die immunangereicherte Fraktion wird stromabwärts gesammelt. Die unterste Fraktion, die alle roten Blutkörperchen enthält, verbleibt im Röhrchen und wird verworfen. (C) Beispielabbildung, die komplette Schichten darstellt. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Färbung extrazellulärer AntikörperBlockierung: Die Zellen werden auf eine 96-Well-Platte mit rundem Boden auf Eis übertragen und bei 500 x g mit einer Bremse zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie schnell den Überstand in der Spüle, indem Sie die Platte schnippen, um den Überstand zu entsorgen, und lassen Sie das Zellpellet intakt am Boden der Vertiefung. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μl FACS-Puffer mit einem Anti-Maus-CD16/32-FC-Rezeptor-Blockierungsreagenz unter Verwendung einer P200-Pipette (Endkonzentration 10 μg/ml, Verdünnungsfaktor 1:50), um eine unspezifische Bindung von Antikörpern an Monozyten oder andere FcR-tragende Zellen zu verhindern. 10 Minuten auf Eis inkubieren. Antikörper-Färbung: Bereiten Sie das entsprechende Volumen eines 2-fachen Mastermixes vor, der P2RY12-Allophycocyanin (APC; Verdünnungsfaktor 1:50, Konzentration 4 μg/ml für eine Endwell-Konzentration von 1:100, Konzentration 2 μg/ml) und violette 525-Lebendtotfärbung (Verdünnungsfaktor 1:50 für eine Endwell-Konzentration von 1:100) enthält. 50 μl der Färbe-Mastermischung werden in die Zellsuspension gegeben (erhalten nach dem Blockieren in Abschnitt 1.5.1) und die Platte 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis inkubiert.HINWEIS: Für dieses Protokoll stellen wir die Färbung der Zellen mit P2RY12 vor. Erstens ist P2RY12 ein homöostatischer Marker für Mikroglia, der in bestimmten Krankheitskontexten herunterreguliert werden kann. Zum Beispiel haben 5XFAD-Alzheimer-Modellmäuse den P2RY12-Spiegel herunterreguliert, was die Identifizierung von22 erschweren könnte. Alternative Farbstoffe, die für die Isolierung verwendet werden können, sind Tmem119, Cd11b und CD4523. Zweitens kann das Konjugat Fluorochrom APC an das gewünschte Antikörperpanel angepasst werden. Die Wahl eines hellen Fluorochroms, wie z. B. APC oder PE, trägt jedoch dazu bei, dass die positiven und negativen Populationen leicht zu unterscheiden sind24. Geben Sie nach dem Färben 200 μl FACS-Puffer direkt in jede Vertiefung, um die Zellen zu waschen. Bei 500 x g bei 4 °C schleudern, um den Überstand durch Schnippen zu entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer P200-Pipette in 200 μl FACS-Puffer, schleudern Sie sie bei 500 x g bei 4 °C und drehen Sie die Platte, um den Puffer aus den Vertiefungen zu entfernen. Vorbereiten von Flusskontrollen: Trennen Sie vor der Färbung die erforderlichen Zellvolumina von jeder Probe nach der Blockierung in Schritt 1.5.1 für die erforderlichen Flusskontrollen.HINWEIS: Für jedes Experiment sind Durchflusskontrollen erforderlich, um die Gates einzurichten. Die Durchflusskontrollen können von einem zusätzlichen Tier oder von einem Bruchteil jedes der Versuchsbrunnen entnommen werden. Stellen Sie beim Teilen von Zellen sicher, dass genügend Zellen pro Kontrolle zugewiesen werden, da 10.000-30.000 Zellen pro Kontrolle erforderlich sind, um Gatter mit hoher Zuverlässigkeit einzurichten.Es gibt drei relevante Flusskontrollen: keine Färbung, lebend tot und P2RY12-Isotypkontrolle. Für die Fleckenkontrolle dürfen keine Antikörper hinzugefügt werden. In der P2RY12-Isotypkontrolle werden die Zellen mit dem Viabilitätsfarbstoff (1:100) und einem Isotyp-Kontrollantikörper behandelt, der an APC (1:100) konjugiert ist. Um die Lebendtotenkontrolle vorzubereiten, werden die Zellen aliquot in eine separate Vertiefung gegeben und die Hälfte des Zellvolumens in ein 500-μl-Röhrchen umgefüllt. Legen Sie das 500-μl-Röhrchen für 5 Minuten in den Gefrierschrank bei -80 °C und legen Sie es anschließend für 5 Minuten in einen 37 °C-Inkubator, um die Zellen abzutöten. Das Aliquot der toten Zellen wird in die Kontrollvertiefung für lebende Tote zurückgeführt und mit einem aminbindenden Viabilitätsfarbstoff auf violettes 525 (Verdünnungsfaktor 1:100) eingefärbt, um tote Zellen zu markieren.HINWEIS: Das Protokoll ist für die Plattenfärbung mit einer Flick-Methode zur Entfernung von Überständen geschrieben. Dies setzt jedoch voraus, dass der Überstand unmittelbar nach Beendigung des Schleuderns entfernt wird, und der Flick muss mit genügend Kraft ausgeführt werden, um den Überstand schnell zu entfernen, ohne das Pellet zu stören. Alternativ können 1,5 mL RNAse/DNase-freie Röhrchen für die Färbung verwendet werden, mit den folgenden Modifikationen: Die Zellen werden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und ein Pellet bei 800 x g für 5 min bei 4 °C überführt. Überstand mit Pipetten absaugen. Tipp: Für die Geschwindigkeit kann eine 5-ml-Transferpipette mit einer P200-Spitze den Überstand schnell und genau ansaugen. Beim Ansaugen auf das Pellet achten. Wenn das Pellet nicht sichtbar ist, lassen Sie 50 μl Überstand stehen und passen Sie die Berechnungen entsprechend an. Wenn Sie Antikörper auswaschen, fügen Sie zusätzliches FACS hinzu, um die Verdünnung der Antikörper zu erhöhen (1000 μl statt 200 μl), um die unvollständige Entfernung des Überstands zu berücksichtigen. Verwenden Sie je nach Zytometer die 1,5-ml-Röhrchen zum Sortieren, wodurch die Menge der erforderlichen Verbrauchsmaterialien reduziert wird. FACS-Sortierung für MikrogliaZubereitung: Resuspendieren Sie jede Vertiefung in 200 μl FACS-Puffer mit einer P200-Pipette und füllen Sie sie in markierte Durchflusssortierröhrchen um und fügen Sie den FACS-Puffer zu insgesamt 500 μl hinzu, um eine Konzentration von ca. 5 x 105 Ereignissen pro ml zu erreichen. Bis zur Analyse im Dunkeln auf Eis lagern. Bereiten Sie die Röhrchen nach der Sortierung vor, indem Sie 100 μl FACS-Puffer als Polster für Zellen in 1,5-ml-RNAse-freien Röhrchen hinzufügen. Zytometereinstellungen: Sortieren Sie Zellen auf einem Durchflusszytometrie-Zellsortierer, der mit der 100-μm-Düse eingerichtet ist. Sortieren Sie Zellen mit 18-20 psi. Gating: Auf dem Zytometer wird das Gate für die Zellgröße mit der Side-Sclitter-Fläche (SSC) im Vergleich zur Vorwärtsstreuung (FSC)-Höhe unter Verwendung der No-Stain-Kontrolle zur Unterscheidung von Ablagerungen platziert, SSC-A auf eine logarithmische Achse gelegt, um eine Zellpopulation zu visualisieren, und das Gate für die Selektion nach Zellen (Gate S1; Abbildung 3). Um alle Dubletten zu entfernen, plotten Sie FSC-H vs. FSC-W und Gate dicht um die Zellpopulation herum, um alle Trümmer und Dubletten zu entfernen (Gate S2). Untersuchen Sie mit der P2RY12-Isotypkontrolle die Zellen im APC-Kanal und stellen Sie das Gate für die Autofluoreszenz ein, um P2RY12+-Zellen zu bestimmen. Mit den Kontrollen ohne Färbung und lebend tot werden die Zellen, die auf violetten 525 nm nicht fluoreszieren, als lebende Zellen markiert. Sortierung: Zeichnen Sie violett 525 nm vs. APC auf und bestimmen Sie die Population, die P2RY12+ ist und von FMOs (MG) lebt. Sortieren Sie diese Zellen in das beschriftete Post-Sort-Röhrchen (Abbildung 3). Der endgültige Sortierprozentsatz beträgt etwa 50 % der Gesamtereignisse, wobei der Großteil des Gesamtverlusts des Ereignisses Trümmer sind, die in Gate S1 entfernt wurden (~70 % der Ereignisse sind Zellen; Tabelle 1). RNA-Isolierung und -AnalyseTranskriptions- und Translationsinhibitoren: Wenn Sie eine RNA-Extraktion planen, sollten Sie Translations- und Transkriptionsinhibitoren in die Pufferschritte einbeziehen, um das Risiko von isolationsassoziierten transkriptomischen Signaturen zu eliminieren. Bereiten Sie den Inhibitor-Cocktail wie von Marsh et al. beschrieben vor, einschließlich Actinomycin D, Anisomycin und Triptolid25.Inhibitor-Zubereitung: Inhibitor-Vorräte rekonstituieren und wie folgt lagern: Actinomycin D in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf 5 mg/ml rekonstituieren und bei -20 °C lagern. Triptolid in DMSO auf 10 mM rekonstituieren und bei -20 °C lichtgeschützt lagern. Rekonstituieren Sie Anisomycin in DMSO auf 10 mg/ml und lagern Sie es bei 4 °C, geschützt vor Licht. Lagern Sie alle Hemmstoffvorräte nicht länger als 1 Monat nach der Rekonstitution. Puffermodifikationen: Fügen Sie Inhibitoren in vier verschiedenen Puffern im Protokoll wie folgt hinzu: Bei der Durchführung der transkardialen Perfusion HBSS mit Actinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 ab Vorrat) und Triptolid (10 μM, 1:1000 ab Vorrat) herstellen. Nach der Perfusion werden die Gehirne in HBSS mit Actinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 ab Lager), Triptolid (10 μM, 1:1000 ab Lager) und Anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 ab Lager) ins Labor transportiert. FACS-Puffer mit Actinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 ab Lager), Triptolid (10 μM, 1:1000 ab Lager) und Anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 ab Lager) herstellen. Aufschlusspuffer mit Actinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 ab Lager), Triptolid (10 μM, 1:1000 ab Lager) und Anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 ab Lager) vorbereiten. Bereiten Sie einen Waschpuffer nach der Sortierung vor, wobei HBSS Actinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 ab Lager), Triptolid (10 μM, 1:1000 ab Lagerbestand) und Anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 ab Lager) enthält.HINWEIS: Wenn Sie die Inhibitoren hinzufügen, stellen Sie sicher, dass Sie sie unmittelbar vor der Verwendung hinzufügen und alle vorbereiteten Puffer während des Gebrauchs vor Licht schützen. Vermeiden Sie das Einfrieren und Auftauen von Stammlösungen. Waschen nach dem Sortieren: Da die Zellen in 1,5-ml-RNase-freie Röhrchen in FACS-Puffer sortiert wurden, was die RNA-Isolierung stört, ist es notwendig, die Zellen zu waschen. Schleudern Sie die Zellen bei 1000 x g bei 4 °C für 5 Minuten und entfernen Sie den Überstand, wobei etwa 50 μl Flüssigkeit übrig bleiben. 200 μl 1x HBSS mit Actinomycin D (5 μg/ml, 1:1000 ab Vorrat), Triptolid (10 μM, 1:1000 ab Lager) und Anisomycin (27,1 μg/ml, 1:368,5 ab Vorrat) zugeben und gründlich mischen. Wiederholen Sie den Schleudergang und entfernen Sie den Überstand, so dass 50 μl Flüssigkeit übrig bleiben (Waschen 1). Fügen Sie 200 μl Waschpuffer nach der Sortierung hinzu, mischen Sie gründlich und wiederholen Sie den Schleudergang und entfernen Sie den Überstand, wobei 25 μl Flüssigkeit übrig bleiben (Waschgang 2). RNA-Extraktion: Verwenden Sie für die RNA-Isolierung aus Mikrogliazellen ein RNA-Isolierungskit mit geringem Input, um hohe und konsistente RNA-Ausbeuten und RIN-Werte über 9 zu erzielen (siehe unten und Materialtabelle für Produktempfehlungen). Fügen Sie dem Zellpellet 350 μl des Lysepuffers aus dem empfohlenen Kit + β-Mercaptoethanol (1:100) hinzu und mischen Sie es gut.HINWEIS: Falls erforderlich, kann das Protokoll an dieser Stelle ausgesetzt werden. Die Proben können bis zur RNA-Extraktion im Lysepuffer bei -80 °C gelagert werden. Wenn Sie die RNA nach der Lagerung extrahieren, tauen Sie das Lysat auf Eis auf und fahren Sie mit den kitspezifischen Anweisungen für die Isolierung fort. Lysat in einen säulenbasierten Zellzerkleinerer überführen (siehe Materialtabelle für Produktempfehlungen) und 2 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C zentrifugieren. In mindestens 14 μl RNase-freiem Wasser eluieren und die Konzentration entsprechend bestimmen. RNA kann nach diesem Zeitpunkt für jede Downstream-Anwendung verwendet werden. Abbildung 3: Anschnittstrategie für die Strömungssortierung. Ereignisse werden für die Zellengröße auf SSC-A im Vergleich zu FSC-H (S1) festgelegt. Dann werden die Zellen als Singuletts auf FSC-H vs. FSC-W (S2) bezeichnet. Singulett-Zellen werden unter Verwendung der P2RY12-Isotyp-Kontrolle als lebend sortiert, wenn sie auf Comp-FL8-A::405-526-52 negativ sind (violette 525 lebende tote Färbung) und als P2RY12+, wenn sie positiv auf Comp-FL32-A::640-671_30 (P2RY12-APC) sind. Die Zellen werden als MG markiert und sortiert, wenn sie sowohl lebend als auch P2RY12+ sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. GESCHLOSSENE BEVÖLKERUNG Häufigkeit der übergeordneten Häufigkeit der Gesamtanzahl Zählen S1 68.10% 68.10% 162186 S2>S1 93.59% 63.70% 151707 P2Ry12+ (670+) > S2 > S1 83.05% 52.90% 125986 Live (525-) > S2 > S1 92.78% 59.10% 140752 MG (P2RY12+ Live) >S2>S1 78.96% 50.30% 119794 Tabelle 1: Beispiel für eine Beispielherkunftstabelle mit Gating-Prozentsätzen und erwarteten Ereignisnummern. 2. Intranukleäre Durchflussfärbung für die Proteinexpressionsanalyse HINWEIS: Andere Zelltypen können zu diesem Zeitpunkt gestartet werden, dieses Protokoll wird mit kultivierten Zellen getestet, einschließlich HEK293-Zellen, BV2-Mikroglia-ähnlichen Zellen und menschlichen IPSC-abgeleiteten Mikroglia. Fixierung und Färbung von ZellenHINWEIS: Verwenden Sie für das folgende Protokoll ein intrazelluläres Färbekit, das für die Kernfärbung optimiert ist. Siehe Material-Tabelle für Produktempfehlungen.Aliquot extrazellulär gefärbte Zellen aus Abschnitt 1.5.2 in 96-Well-Platten (5 x 104- 1 x 106 Zellen). Schleudern Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 500 x g bei 4 °C und schnippen Sie, um den FACS-Puffer zu entfernen.HINWEIS: Um Daten mit hoher Konfidenz der Medianwerte zu erhalten, sollten mindestens 10.000 Zellen pro Vertiefung verwendet werden. Es gibt zwar kein empfohlenes Maximum, aber es ist am besten, die Anzahl der Zellen während des gesamten Experiments konstant zu halten, um sicherzustellen, dass es keine signifikanten Auswirkungen unterschiedlicher Variationskoeffizienten (CV) gibt. Fixierung und Permeabilisierung: Fügen Sie 200 μl 1x fixes Konzentrat hinzu und mischen Sie es vorsichtig mit der P200-Pipette, um die Zellen zu resuspendieren. 45-60 Minuten im Dunkeln inkubieren. Zentrifugieren Sie die Platte 5 Minuten lang bei 500 x g bei Raumtemperatur (RT) und schnippen Sie, um den Überstand zu entsorgen.HINWEIS: Falls erforderlich, kann das Protokoll an dieser Stelle ausgesetzt werden. Nach dem Verwerfen des Überstandes werden die Zellen erneut in einen Langzeitspeicherpuffer für Immunzellen versetzt (siehe Materialtabelle für Produktempfehlungen). Die Proben können 12-18 h bei 4 °C gelagert, vor Licht geschützt und mit einer transparenten Folie abgedeckt werden, um die Pufferverdunstung zu schützen. Geben Sie 200 μl 1x Permeabilisierungspuffer in jede Vertiefung und pipettieren Sie sie mit einem P200 zum Mischen. Zentrifugenplatte 5 min bei 500 x g bei RT zentrifugieren und schnippen, um den Überstand zu verwerfen. Permeabilisierungspufferwäsche insgesamt 3x wiederholen. Vorbereitung der Durchflusskontrollen: Teilen Sie das Zellvolumen aus jeder Probe auf, um die erforderlichen Durchflusskontrollen durchzuführen (10.000-30.000 Zellen pro Kontrollvertiefung sind ausreichend).Um die No-Färbe-Kontrolle vorzubereiten, fixieren Sie die No-Färbe-Zellen aus den ungefärbten Zellen der Sortierung oder Aliquote in einer separaten Vertiefung, die keine Antikörper erhält. Um die Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrolle (FMO) vorzubereiten, werden die Zellen für jeden der Antikörper auf dem Panel mit Ausnahme des Antikörpers in diesem Kanal aliquotiert. Fügen Sie für die relevanten Kanäle den Isotyp-Kontrollantikörper in die FMO für das Gating ein. Zum Beispiel sollte es in einem Panel, das P2RY12-APC und H3K27Ac-AlexaFluor568 enthält, zwei FMOS geben: (1) das APC-FMO, das nur H3K27Ac-AlexaFluor568 und den Isotyp-Kontrollantikörper P2RY12 enthält, und (2) das 568-FMO, das nur P2RY12-APC und die Isotyp-Kontrolle primär und 568 sekundär enthält.HINWEIS: Dieses Protokoll wird vorgestellt, um ein einzelnes HPTM zu testen, es können jedoch Panels erstellt werden, die viele HPTMs enthalten, die mit verschiedenen Fluorophoren konjugiert sind. Färbung von Primärantikörpern: Geben Sie 50 μl 1x Permeabilisierungspuffer mit der entsprechenden Konzentration des Primärantikörpers in jede Vertiefung. 30 Minuten bei RT im Dunkeln inkubieren. 2x mit 200 μl 1x Permeabilisierungspuffer waschen.HINWEIS: Die Konzentration der für jedes HPTM verwendeten Antikörper ist in der Materialtabelle enthalten. Die Konzentration wird bestimmt, indem verschiedene Konzentrationen der Antikörper an kultivierten Zellen getestet werden, die mit einem Stimulans behandelt wurden, das einen dramatischen Anstieg verursachen würde, z. B. einem HDAC-Inhibitor für Acetylierungsmarkierungen, und sichergestellt wird, dass sowohl unbehandelte als auch behandelte Zellen innerhalb des Nachweisbereichs liegen (oberhalb der Isotypkontrolle und unterhalb des maximalen Nachweisbereichs des Zytometers). Die optimale Antikörperkonzentration für HPTMs sollte eine durchschnittliche mediane Fluoreszenzintensität im Fluorophorkanal zwischen 5 x 104 und 1 x 105 aufweisen. Sekundäre Antikörperfärbung: Mit 200 μl 1x Permeabilisierungspuffer mit 2 % normalem Eselsserum (NDS) für 10 min bei RT blockieren. 5 min bei 500 x g bei RT schleudern und schnippen, um den Überstand zu entfernen. 50 μl 1x Permeabilisierungspuffer mit 2 % NDS und der entsprechenden Konzentration des Sekundärantikörpers zugeben und 30 min bei RT im Dunkeln inkubieren. Geben Sie 200 μl 1x Permeabilisierungspuffer in Vertiefungen, um sie zu verdünnen, zentrifugieren Sie die Platte 5 Minuten lang bei 500 x g bei RT und schnippen Sie, um den Überstand zu verwerfen. Waschen Sie die Zellen 2x mit 200 μl 1x Permeabilisierungspuffer.HINWEIS: Halten Sie das Protokoll an dieser Stelle ggf. an. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl Langzeitspeicherpuffer für Immunzellen mit einer P200-Pipette (siehe Materialtabelle für Empfehlungen) und lagern Sie sie bei 4 °C für 12-24 Stunden lichtgeschützt. Vorbereitung für die Durchflusszytometrie: Zentrifugieren Sie die Platte 5 Minuten lang bei 500 x g bei RT und schnippen Sie, um den Überstand zu verwerfen. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl FACS-Puffer mit einer P200-Pipette für die Durchflusszytometrie. Versiegelung mit transparenter Folie für den Transport zum Zytometer. DurchflusszytometrieUm das vorgeschlagene Antikörperpanel zu analysieren, stellen Sie sicher, dass das Zytometer mit mindestens vier Lasern ausgestattet ist, darunter violett (405 nm), blau (488 nm), gelb (561 nm) und rot (633 nm). Das Zytometer benötigt Filter, um FITC (blau-525 nm), KRO (violett-525 nm), PE (gelb-585 nm) und APC (rot-660 nm) zu erkennen. Fügen Sie je nach gewähltem Zytometer zusätzliche Antikörper hinzu. Kalibrierung und Standardisierung: Lassen Sie zu Beginn jedes Experiments Regenbogenfluoreszenzperlen laufen und passen Sie die Spannung der Photomultiplierröhre (PMT) an, bis die Kügelchenspitzen mit den Zielwerten früherer Experimente vergleichbar sind. Diese Methode der Standardisierung ermöglicht es, die Drift der Ausrüstung im Laufe der Zeit auszugleichen. Kompensation: Nachdem die PMT-Spannung und -Verstärkung für das Experiment eingestellt wurden, verwenden Sie Antikörper-eingefangene Kompensationskügelchen, um die Kompensationsmatrix für das Antikörperpanel festzulegen. Diese Berechnung stellt sicher, dass die Fluorophore nicht zu den Signaländerungen in anderen Kanälen beitragen. Dies ist zunehmend notwendig, wenn mehrere Antikörper gemultiplext werden. Größen-Gating: Zeichnen Sie in einem Punktdiagramm SSC-A auf log im Vergleich zu FSC-H auf linear. Entfernen Sie Trümmer und wählen Sie die Zellengröße mit dem S1-Gate aus. Wählen Sie für Singulett-Zellen in einem Punktdiagramm von FSC-W vs. FSC-H und Gate als S2 aus. (Abbildung 4). Etablierung von Fluorophor-Gattern: Legen Sie unter Verwendung des relevanten FMO für jeden Fluorophorkanal die Gates fest, um anhand von Histogrammen mit einzelnen Parametern zu bestimmen, was ein positives Signal in jedem Kanal ist (Abbildung 4). Vermessung der Proben: Nehmen Sie die Proben sorgfältig mit der etablierten Anschnittstrategie auf. Identifizierung der Mikroglia mit Hilfe des P2RY12+-Signals, Bestimmung der Expression des Proteins in den jeweiligen Kanälen nur für die Mikroglia. Datenanalyse der DurchflusszytometrieEinrichten von Analyse-Gates: Verwenden Sie die obigen Schritte für das Zytometer auf der Benutzeroberfläche der Analysesoftware und verwenden Sie dieselben Gates, die für die Aufzeichnung für die Analyse verwendet werden. Ermitteln Sie MFI-Werte mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware (siehe Materialtabelle für Empfehlungen): Rekapitulieren Sie die Zytometer-Gating-Strategie für die Durchflussanalyse. Wählen Sie mit der Funktion “Statistiken hinzufügen” den Median für die interessierende Grundgesamtheit (z. B. 568+) auf der kompensierten Kanalhöhe aus. Exportieren Sie mit dem Tabelleneditor die mittleren Werte für die Fluoreszenzintensität (MFI) für die jeweiligen Kanäle in eine Tabelle, um mit der statistischen Analyse fortzufahren (Tabelle 2).ANMERKUNG: Die Zusatzdatei S1 enthält Beispieldaten von mit Lipopolysaccharid (LPS) und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) injizierten Mäusen sowie eine Beispielanalysedatei mit der Gating-Strategie und den MFI-Werten. Analyse der MFI-Werte zur Proteinfaltungsänderung: Berechnen Sie nach Erhalt der MFI-Werte die Faltungsänderung des MFI relativ zur Kontrollpopulation oder zur unbehandelten Population (Gleichung 1). Die MFI-Faltungsänderung spiegelt die Faltenänderung der Proteingehalte wider. Bewerten Sie anhand der Faltungsänderungswerte die Änderung der Ausprägung, und berechnen Sie die statistische Signifikanz mithilfe eines t-Tests oder einer ANOVA.Gleichung 1 Abbildung 4: Gating-Strategie für die Bewertung von Protein-MFIs. Ereignisse werden zuerst für die Zellengröße auf SSC-A im Vergleich zu FSC-H (S1) festgelegt. Die Zellen werden dann für Singuletts auf FSC-H vs. FSC-W (S2) abgegrenzt. Singulettzellen werden dann durch das P2RY12-APC-Signal (APC+) als Mikroglia identifiziert, wobei das Gate auf der Grundlage der Fluoreszenz in einer APC-FMO-Kontrolle hergestellt wird, die einen Isotyp-Kontrollantikörper enthält. Die Zellen werden dann für das H3K27Ac-AlexaFluor568-Signal auf Comp-FL5-A::Y610-mCherry angesteuert. Die Fluoreszenzintensität der 610+ Zellen wird als Proxy für die Proteinexpression bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.