JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Biliyer atrezi çalışması için kronik karaciğer fibrozisinin bir fare modeli

Published: February 03, 2023
doi:
10.3791/65044
, , , ,
1School of Medicine,South China University of Technology, 2Provincial Key Laboratory of Research in Structure Birth Defect Disease and Department of Pediatric Surgery,Guangzhou Women and Children’s Medical Center

Summary

Biliyer atrezinin (BA) virüs kaynaklı karaciğer fibrozis mekanik çalışması için uygun bir hayvan modeli ve gelecekteki BA tedavileri için bir platform sağlayan kronik karaciğer fibrozisinin fare modelini oluşturduk.

Abstract

Biliyer atrezi (BA) obstrüktif sarılığı içeren ölümcül bir hastalıktır ve çocuklarda karaciğer transplantasyonu için en sık endikasyondur. Karmaşık etiyolojisi ve bilinmeyen patogenezi nedeniyle halen etkin bir ilaç tedavisi bulunmamaktadır. Günümüzde, rhesus rotavirüsü (RRV) tarafından indüklenen klasik BA fare modeli, BA’nın patogenezini incelemek için en yaygın kullanılan modeldir. Bu model büyüme geriliği, cilt ve mukoza sarılığı, kil dışkı ve koyu sarı idrar ile karakterizedir. Histopatoloji, şiddetli karaciğer iltihabı ve insan BA semptomlarına benzer intrahepatik ve ekstrahepatik safra kanallarının tıkanmasını gösterir. Bununla birlikte, bu modeldeki son dönem farelerin karaciğerleri fibrozdan yoksundur ve klinik BA’da karaciğer fibrozisinin özelliklerini tam olarak simüle edemez. Sunulan çalışma, her enjeksiyondan sonra 2 günlük boşluklarla dört kez 5-10 μg anti-Ly6G antikoru enjekte ederek kronik karaciğer fibrozisinin yeni bir BA fare modelini geliştirdi. Sonuçlar, farelerin bazılarının, zaman atlamasından sonra tipik fibrozis ile kronik BA’yı başarıyla oluşturduğunu gösterdi; bu, bu farelerin, BA’nın virüs kaynaklı karaciğer fibrozis mekanik çalışması için uygun bir hayvan modelini ve gelecekteki BA tedavilerini geliştirmek için bir platformu temsil ettiği anlamına geliyor.

Introduction

Biliyer atrezi (BA), sıklıkla bebeklerde ve küçük çocuklarda görülen ciddi bir hepatobiliyer hastalıktır; spesifik olarak, yenidoğan sarılığı ve soluk dışkı ile obliteratif bir kolanjiyopati olarak ortaya çıkar1. Klinik özellikleri, intrahepatik ve ekstrahepatik safra kanallarının enflamatuar yıkımı ve sonunda karaciğer yetmezliğine dönüşen ilerleyici fibrozdur2. İstatistiklere göre, Asya ülkelerinde BA insidansı Avrupa ve Amerika ülkelerinden daha yüksektir ve Asya ülkelerinde BA insidansı 1/8.000’dir. BA’nın etiyolojisi viral enfeksiyon, anormal safra yolu gelişimi, immün bozukluklar ve genetik varyasyonları içerir3. Kasai cerrahisi, BA’lı çocuklarda kolestazı iyileştirmek için en sık kullanılan yöntemdir, ancak sonuçta bu, fibrozis4’ün ilerlemesini önleyemez. BA için mevcut tedavi esas olarak karaciğer kaynaklarının eksikliği ile sınırlı olan karaciğer transplantasyonuna dayanmaktadır. BA’nın patogenezinin derinlemesine incelenmesi, bu hastalığın zorluklarını çözmenin en doğrudan yoludur. Bununla birlikte, BA’nın patogenezi ile ilgili çalışmalar esas olarak BA hayvan modellerine dayanmaktadır ve uygun bir hayvan modeli seçmek çok önemlidir.

BA’nın histopatolojik çalışmalarının çoğu, safra kanalı hiperplazisi (BDP), safra trombozu ve portal ven fibrozisinin BA’nın en önemli patolojik özellikleri olduğunu ve portal inflamatuar hücre infiltrasyonu ve hepatosit şişmesi gibi farklı derecelerdeki diğer patolojik özelliklerin aynı anda var olduğunu göstermiştir 5,6. Şu anda, segmental safra kanalı tıkanıklığı ve ekstrahepatik safra kanalları7’yi içeren perikolanjit ile kronik 3,5-die-thoxycarbonyl-1,4-dihidrokollidin (DDC) ile beslenen fare modeli ve intraperitoneal karbon tetraklorür8 enjeksiyonu ile karaciğer fibrozisinin fare modeli gibi BA’yı taklit eden çeşitli fare modelleri vardır. Safra kanalı ligasyonu (BDL) modeli sarılık ve hızlı portal ven fibrozisi9 ile karakterizedir. Alfa-naftilizotiyosiyanat (ANIT) ile beslenen fare modeli, intrahepatik safra kanalı ile sınırlı kolanjit ve hepatosit hasarı ile karşımıza çıkar10. Uzun süreli sarılığı olan bir fare modeli, gecikmiş rhesus rotavirüs (RRV) aşılaması ile indüklenir11. Başta fare modelleri olmak üzere çeşitli hayvan modelleri olmasına rağmen, her modelin kendine özgü sınırlamaları vardır. Biliyer atrezi sürecinde akut inflamasyon veya karaciğer fibrozu gibi BA’nın hastalık özelliklerinin sadece bir kısmını simüle edebilirler ve hastalık süreci ve BA’nın patolojik özellikleri ile oldukça tutarlı bir model yoktur.

Klasik BA fare modeli RRV tarafından indüklenir ve bu model insanlarda BA’ya en benzer modeldir. Bununla birlikte, RRV’nin neden olduğu BA model fareler, ekstrahepatik biliyer atrezinkilerin bazılarına benzer klinik semptomlar ve patolojik özellikler gösterirken, bu model, BA mekanizmalarının derinlemesine incelenmesini ve yeni tedavilerin geliştirilmesini büyük ölçüde sınırlayan karaciğer fibrozundan yoksundur12. Bu nedenle, bu çalışma kronik karaciğer fibrozisinin yeni bir BA fare modelini geliştirdi. Anti-Ly6G antikoru doğum günü RRV aşılamasından önce intraperitoneal olarak enjekte edildi. Daha sonra, 5-10 μg anti-Ly6G antikoru dört kez enjekte edildi ve her enjeksiyon arasında 2 günlük boşluklar oldu. Farelerin BA semptomları düzeldi, hayatta kalma süresi uzadı ve fareler kronik fibroz aşamasına girdi. Bu model sadece BA’nın akut faz yanıtını simüle etmekle kalmaz, aynı zamanda karaciğer ve ilerleyici fibroz süreçlerini de taklit eder. Bu nedenle, BA’nın mekanik çalışması için daha uygun bir hayvan modelidir ve BA için gelecekteki tedavileri geliştirmek için teorik bir temel sağlayabilir.

Gr-1 molekülü, başlangıçta nötrofiller13’te eksprese edildiği tespit edilen miyeloid türevli bir hücre yüzey belirtecidir. Anti-Ly6G antikorlarının tükenmesi, dolaşımdaki nötrofilleri% 90’dan fazla azaltır ve diğer bağışıklık hücreleri tarafından aktive edilen yanıtı değiştirir. Gr-1+ hücre popülasyonlarının fonksiyonları, spesifik süpürücü antikorlar kullanılarak yapılan çeşitli çalışmalarda, sitokinler ve aracılı immün koruma14 üzerinde çeşitli etkiler tespit edilmiştir. RRV aşılı BA fare modellerinde Gr-1 + hücrelerinin işlevini inceledik. Bununla birlikte, Gr-1 molekülünün insanlarda eksprese edildiği bulunmadığından, benzer bir molekül olan CD177, BA hastalarında incelenmiştir15. Verilerimiz, özellikle hastalığın kronik fibrotik fazında Gr-1 + hücre popülasyonlarının önemini kanıtlamakta ve potansiyel BA tedavilerini araştırmak için uygun bir hayvan modeli sunmaktadır.

Protocol

Bu çalışma, tüm hayvan deneylerinin yapıldığı Guangzhou Yongnuo Biyomedikal Hayvan Merkezi (IACUC-AEWC-F2208020) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Kronik fibrotik BA fare modelinin oluşturulması NOT: Tüm hayvanlar aynı odada belirli bir patojensiz (SPF) ortamda tutuldu ve deneyler geleneksel bir ortamda gerçekleştirildi. Gebeliğin 12.5. gününde (yaş: 10-12 hafta; ağırlık 35-40 g) BALB / c fareleri, 12 saatlik karanlık / aydınlık bir döngü altında 25 ° C’de spesifik patojenler içermeyen bir odada tutuldu ve otoklavlanmış yiyecek ve suya serbest erişim sağlandı. Yenidoğan fareler, doğumdan sonraki 24 saat içinde (ortalama vücut ağırlığı: 1.5-1.6 g), fare BA modeli için seçildi. RRV’yi daha önce bildirildiği gibi hazırlayın16.NOT: Model farelerin zayıf hayatta kalma durumları nedeniyle, aynı kafesteki diğer fareler tarafından ısırılmalarını ve hatta öldürülmelerini önlemek için 21 günlükken ayrılmaları gerekir. Yenidoğan fareleri üç gruba ayırın: kontrol grubu, RRV grubu ve RRV + anti-Ly6G grubu. İntraperitoneal olarak yenidoğan farelere doğumdan sonraki 24 saat içinde 20 μL RRV (titre: 1.5 x 106 PFU / mL) (RRV grubu) veya salin (kontrol grubu) enjekte edin. Gr-1+ hücrelerini tüketmek için, RRV enjeksiyonundan 4 saat önce her fareye 5 μg anti-Ly6G antikorunun intraperitoneal enjeksiyonu ile ön işlem uygulayın.NOT: Anti-Ly6G antikor çözeltisi 2-8 °C’de saklanır ve dondurulmamalıdır. Kullanmadan önce antikoru çıkarın ve ısınmak için 30 dakika oda sıcaklığına koyun. RRV enjeksiyonundan sonra 12. güne kadar her 3 günde bir farenin karnına 10 μg anti-Ly6G antikoru enjekte edin (Şekil 1A). Günlük olarak tüm farelerin görünümünü, ağırlığını ve hayatta kalmasını kontrol edin ve kaydedin. 2. Farelerin intraperitoneal enjeksiyonu Yenidoğan fareleri kafesten çıkarın. 20 μL RRV çözeltisi veya 50 μL anti-Ly6G antikor çözeltisi enjekte etmek için 1 mL’lik bir insülin şırıngası kullanın. Genç farenin boyun derisini bir elin işaret parmağı ve baş parmağı ile sıkıştırın ve karnını ortaya çıkarmak için farenin arka ayaklarını yüzük parmağı ve kuyruk parmağıyla hafifçe tutun. İğneyi yukarı doğru bir eğimle kaldırın. İğneyi farenin sağ arka bacağının orta uyluğuna ciltle 15° açıyla yerleştirin. İğne farenin sağ kostal kenarına ulaşana kadar deri altı yolu boyunca hareket ettikten sonra, iğneyi karın boşluğuna doğru aşağı doğru yönlendirin. Ardından, sıvıyı farenin karaciğerinin altına enjekte edin.NOT: Yenidoğan farelerin mide ve dalağı sol karın bölgesindedir. Sol tarafa bir iğne sokulursa, mideyi delmek veya dalak kanamasına neden olmak kolaydır. İğneyi enjeksiyondan hemen sonra dışarı çekin ve enjeksiyon bölgesinde kanama veya sızıntı olup olmadığını gözlemleyin. Varsa, otoklavlanmış bir pamukla silin. Fareyi annesinin kafesine geri döndürün.NOT: Enjeksiyon sırasında sıvı sızıntısının deneysel sonuçlar üzerindeki etkisini azaltmak için, enjeksiyon işleminin yumuşak olduğundan emin olun, iğneyi yavaşça çıkarın ve enjeksiyon bölgesini 30 s boyunca pamuklu çubukla bastırın. 3. Örnek dokunun toplanması 12. günde, fareleri% 4 izofluran inhalasyonu ile uyuşturun ve mikroskop altında diseke edin. Kan toplamak için kalbin sol ventrikülüne 1 mL’lik bir insülin şırıngası yerleştirin. Kan toplandıktan sonra, fareleri 10 dakika boyunca% 4 izofluran soluyarak ötenazi yapın. Kanı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 × g’da santrifüj edin ve karaciğer fonksiyon ölçümleri için serumu ayırın.NOT: Kan alımı fareler hayattayken yapılmalıdır. Fareler ölürse, kan kan damarlarında tutulur ve toplanamaz. Karaciğer ve safra kanalının genel görünümünü fotoğraflayın. Daha sonra, fare karaciğerini ve dalağı çevredeki dokulardan makas ve cımbızla parçalayın.NOT: Karaciğer ve diğer dokular, RNA ve protein ekstraksiyonu için -80 ° C’de toplanır ve saklanır veya histolojik örneklerin hazırlanması için% 10 formaline batırılır. 4. Ekstrahepatik safra kanalının floresein anjiyografisi Fareyi ötenazi yaptıktan sonra, karaciğeri, safra kesesini ve ekstrahepatik safra kanallarını makas ve pamuklu çubuklarla tamamen açığa çıkarın. Bir duruş mikroskobu altında gözlemleyin, floresan boya rhodamine 123’ün (20 mg / mL) 5-10 μL’sini 1 mL insülin şırıngası ile safra kesesine enjekte edin ve fotoğraf çekin. Bu işlem, daha önce16’da bildirilenlerle aynıdır.NOT: Örnek doku toplama ve floresan anjiyografi için aynı gruptaki farklı fareler kullanılır. 5. H &E boyama Taze fare karaciğer dokusunu 24 saat boyunca% 10 formaline batırın. Dokuyu parafine gömdükten sonra, parafin bloğunu 4 μm kalınlığında bölümlere ayırmak için bir parafin mikrotomu kullanın ve aynı slayta iki ardışık bölüm yerleştirin. Parmak izlerini önlemek için operasyonu standartlaştırmak için deneyimli personel gereklidir17. Dilimleri bir dilimleme rafına yerleştirin, ksilen içinde balmumundan arındırın, mutlak etanol,% 95 etanol,% 80 etanol,% 70 etanol ve damıtılmış su içinde art arda nemlendirin ve her birine 5 dakika bekletin. Bölümleri 5 dakika boyunca hematoksilin çözeltisi ile lekeleyin ve 5 saniye boyunca% 1 hidroklorik asit ve% 75 alkol içine batırın. Bölümleri temiz suyla durulayın ve 1 dakika boyunca eozin çözeltisi ile lekeleyin. 6. CK19 ve F4/80 immünohistokimyasal boyama İlk üç adım, H&E boyama bölümündeki doku gömme, bölümleme ve mum giderme adımlarıyla aynıdır. Tris-EDTA tamponu (10 mmol/L Tris baz, 1 mmol/L EDTA çözeltisi, pH 9.0) ile antijen onarımı gerçekleştirin, bölümleri mikrodalga fırında 95°C’de 10 dakika ısıtın ve ardından doğal olarak oda sıcaklığına çıkarın ve soğutun. Endojen peroksidazı gidermek için doku kesitlerini 10 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit çözeltisine yerleştirin. Spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için dilimlere% 5 keçi serumu uygulayın. Bölümlere birincil sıçan anti-fare sitokeratin 19 veya sıçan anti-fare F4/80 monoklonal antikoru ekleyin ve gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca uygun ikincil antikorlarla inkübe edin. Mikroskop altında kromojenik reaksiyonu gözlemlemek için kromojenik bir ajan olarak 3,3′-diaminobenzidin (DAB) kullanın. Resim elde etmek için dilimleri 40x mikroskop altında gözlemleyin ve gerektiğinde analiz edin. 7. Sirius Kırmızı boyama H&E boyama bölümünde açıklandığı gibi doku gömme, bölümleme ve mumdan arındırmanın ilk üç adımını gerçekleştirin. Doku kesitleri hematoksilin ile boyandıktan sonra, her dokuyu oda sıcaklığında 1 saat boyunca 50 μL Sirius Kırmızı boya çözeltisi ile örtün. Slaytları 4 saat boyunca oda sıcaklığında doğal olarak kurutun, her slayta bir damla nötr sakız ekleyin ve kabarcıkları önlemek için dokuyu yavaşça örtmek için bir örtü kayması kullanın. Nötr sakızı katılaştırmak için slaytları 24 saat oda sıcaklığında bırakın. Kollajen birikiminin ayrıntılarını gözlemlemek için polarize kontrast ışık mikroskobu kullanın; Net ve uygun bir görüş alanı seçin ve mikroskopun görsel alanının parlaklığını ve beyaz dengesini ayarlayın. Görüntüleri elde edin ve gerektiğinde 40x mikroskop altında analiz edin.

Representative Results

Farelere doğumdan sonraki 24 saat içinde intraperitoneal olarak 5 μg anti-Ly6G antikoru enjekte edildi ve daha sonra intraperitoneal olarak 4 saat sonra 20 μL RRV enjekte edildi. Daha sonra, 12. güne kadar her 3 günde bir 10 μg anti-Ly6G antikoru enjekte edildi (Şekil 1A). RRV grubunda ortanca sağkalım süresi 13 gündü. Aksine, antikor ile tedavi edilen farelerin çoğunda hafif sarılık gelişti ve kilo kaybı gözlenmedi (Şekil 1C). Farelerin yaklaşık% 20-30’unda uzun süreli sarılık ve düşük vücut ağırlığı ile BA sendromu vardı, ancak 42 günden fazla hayatta kaldı. Anti-Ly6G antikor tedavisinden sonra, Gr-1 + hücrelerinin sayısı15 azaldı ve fareler kronik BA olarak adlandırılan kronik fibroz aşamasına girdi. Örnekler 12. gün ve 42. günde toplandı ve Sirius Red ile boyanmış doku dilimleri karaciğer fibrozunda kademeli bir artış gösterdi. 42 gün boyunca hayatta kalan kronik BA fareleri ayrıntılı analizler için kullanıldı. Küçük boyuta ek olarak, kulaklar, ayaklar ve kuyruk derisi belirgin sarılık gösterdi (Şekil 1E’deki mavi oklar). RRV enjeksiyonundan sonraki 6. günde, farelerin dışkı rengi daha açık hale geldi ve idrar rengi koyulaştı; Bu, RRV grubu farelerin beyaz dışkı ve koyu sarı idrar gösterdiği 12. günde kontrol grubundan önemli ölçüde farklı hale geldi. 42. günde, kronik BA farelerinin idrar ve dışkıları da sarılığın belirgin özelliklerini gösterdi (Şekil 1D, E). BA farelerinin karaciğerleri çıkarıldı ve kontrollerinkilerle karşılaştırıldı. Karaciğerler daha küçüktü (Şekil 2B), nekrotik lezyonlar çıplak gözle görülebiliyordu (Şekil 2A, siyah üçgen) ve safra kanalı atrezisi segmenti de ekstrahepatik olarak gözlendi (Şekil 2A, beyaz yıldız). Karaciğer doku kesiti analizi, düşük doz anti-Ly6G tedavisinin portal ven inflamasyonunu azalttığını göstermiştir. Bununla birlikte, 42. günde karaciğer doku dilimlerinde inflamatuar hücre birikimi hala gözlenmiştir (Şekil 3A). Sirius Kırmızı boyama, RRV enjeksiyonundan sonraki 12. günde portal bölgede kollajen birikiminde küçük bir artış gösterdi. Ayrıca, anti-Ly6g antikoru ile tedaviden sonra kollajen ekspresyonunda anlamlı bir değişiklik gözlenmedi, ancak 42. günde BA doku örneklerinde kollajen ekspresyonu anlamlı derecede artmıştır (Şekil 3B). Polarize ışık mikroskobu altında incelendiğinde, kollajen liflerinin komşu karaciğer dokusunda biriktiği gözlendi. BA doku örneklerinde 42. günde ağırlıklı olarak yeşil olan önemli bir kollajen birikimi görüldü (Şekil 3C) ve kilo almadan 42 gün boyunca hayatta kalan farelerde kollajen birikimi daha da arttı. Portal inflamasyonun azalmasıyla birlikte, 12. günde CK19 + safra kanalı hücreleri gözlendi. Bununla birlikte, 42. günde, CK19 + safra kanalı hücrelerinde bir artış görülmesine rağmen, olgun safra kanalları zorlukla tespit edilebiliyordu (Şekil 4A, kırmızı oklar safra kanalı epitel hücrelerini göstermektedir). Kronik BA’lı farelerde ekstrahepatik safra kanalları durumunda, farelerin portal bölgesinin seri diseksiyonu, ekstrahepatik safra kanallarının tıkandığını ve makrofajların enflamatuar infiltrasyonlarına sahip olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 4B, siyah oklar makrofajları göstermektedir). Tek başına RRV ile karşılaştırıldığında, düşük dozda anti-Ly6G antikoru ile tedavi, RRV aşılamasından sonraki 12. günde karaciğer enzim seviyeleri açısından karaciğer hasarını azaltmıştır. Karaciğerdeki alanin aminotransferaz ve alkalen fosfataz düzeyleri kronik BA grubunda normal kontrol grubuna göre daha yüksekti. En belirgin değişiklikler bilirubin düzeylerinde bulundu, RRV + anti-Ly6G fareleri, tek başına RRV’nin aksine, akut BA’da TBIL, DBIL ve IBIL düzeylerinde azalma gösterdi. Kronik BA’lı farelerde, TBIL, DBIL ve IBIL seviyeleri artmıştır (Şekil 5), bu da BA’nın kronik fibroz aşamasında karaciğer fonksiyonunun önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. Şekil 1: RRV ile enfekte biliyer atrezinin bir fare modelinde anti-Ly6G antikor tedavisinin etkileri. (A) Farelerde akut ve kronik faz BA’yı indüklemek için düşük dozda antikorların şematik gösterimi, antikor ve RRV’nin enjeksiyon zamanını gösteren oklarla. (B) Normal kontrol (Devam) grubunda, rhesus rotavirüs (RRV) grubunda ve RRV + anti-Ly6G antikor grubunda farelerin hayatta kalma eğrileri. (C) Her gruptaki farelerin vücut ağırlığı eğrileri. (D) 12. günde her gruptaki farelerin ve dışkı ve idrarlarının temsili görüntüleri. (E) 42. günde her gruptaki farelerin ve dışkı ve idrarlarının temsili görüntüleri. Mavi oklar sarı kulakları ve kuyruğu gösterir. Bu rakam Zhang ve ark.15’in izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: RRV ile enfekte biliyer atrezinin fare modelinde anti-Ly6G antikor tedavisinin karaciğer üzerindeki etkileri . (A) 42. günde kronik BA fareleri (sağda) ve normal fareler arasında karaciğer anatomisi ve ekstrahepatik safra kanalı floresan anjiyografisinin karşılaştırılması. (B) Kronik BA fareleri ile normal fareler arasındaki karaciğer büyüklüğünün karşılaştırılması. Siyah üçgen, kronik BA’lı farelerde karaciğer nekrozunu gösterir. Beyaz yıldız işareti ekstrahepatik biliyer atreziyi gösterir. Bu rakam Zhang ve ark.15’in izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Normal kontrol (Devam) grubundaki, rhesus rotavirüs (RRV) grubundaki ve RRV + anti-Ly6G antikor grubundaki farelerin 12. ve 42. günlerdeki karaciğer dokusu dilimleri . (A) Hematoksilin ve eozin (H&E) ile boyanmış karaciğer dokusu kesitlerinin görüntüleri. (B) Sirius Kırmızı boyama kollajen birikimi (PSR) gösterdi. (C) Polarize ışık mikroskobu (Pol. Light) kullanılarak dilimlerin daha fazla gözlemlenmesi. Kısaltma: PV = portal ven. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam Zhang ve ark.15’ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Normal kontrol (Devam) grubundan, rhesus rotavirüs (RRV) grubundan ve RRV + anti-Ly6G antikor grubundan karaciğer doku dilimlerinin 12. gün ve 42. günde immünohistokimyasal boyanması . (A) Farklı tedavi gruplarında safra kanalı epitel hücreleri belirtecinin (CK19) ekspresyonu. (B) Makrofajların inflamatuar hücre infiltrasyonu farklı tedavi gruplarında gösterilmiştir. Kısaltma: PV = portal ven. Kırmızı ok, safra kanalı epitel hücrelerini gösterir. Siyah ok makrofajları gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam Zhang ve ark.15’ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Farklı tedavi gruplarında farelerde karaciğer fonksiyonlarının karşılaştırılması. Deneyden sonra fare kanı toplandı ve hastanenin laboratuvar bölümünde test edildi. Her grup üç ila beş fare içeriyordu. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Kısaltmalar: ALT = alanin aminotransferaz; AST = aspartat aminotransferaz; ALP = alkalen fosfataz; TBIL = toplam bilirubin; DBIL = doğrudan bilirubin; IBIL = dolaylı bilirubin. Bu rakam Zhang ve ark.15’ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Çalışmamızda, akut BA sendromunu iyileştirmek, hayatta kalma oranını uzatmak ve BA farelerinin kronik faza girmesini sağlamak için RRV ile enfekte olmuş biliyer atrezinin bir fare modelinde Gr-1 + hücrelerini ortadan kaldırmak veya azaltmak için anti-Ly6G antikoru kullandık. Antikor dozunun azaltılması, hepatik fibroz ile kronik BA’ya yol açabilir, bu da Gr-1 + hücrelerinin sayısının akut ve kronik fazlarda BA’nın sonucunu değiştirdiğini gösterir. Önceki çalışmamızda, anti-Ly6G antikorunun uygulanmasından sonra Gr-1 + hücreleri azaltıldı ve BA farelerinin genel sağkalım durumu iyileştirildi15. Aynı zamanda, Gr-1 + makrofajlar19, Gr-1 + nötrofiller 20, Gr-1 + miyeloid hücreler21 ve Gr-1 + granülositlerin bazı hayvan modellerinde fibrozu artırabileceği bildirilmiştir 22. Bununla birlikte, bu çalışmada, farelerdeki Gr-1 + hücreleri, düşük dozlarda anti-Ly6G antikoru ile kısmen tükendi ve kollajen birikintileri kaldı. Sonuç olarak, hastalığı daha ayrıntılı bir şekilde ele almak için daha fazla zamana ihtiyaç duyulabilir.

Anti-Ly6G antikorunun uygulanması inflamasyonu azalttı, safra kanallarını kısmen korudu ve farelerde akut BA kaynaklı ölümü önledi. Bununla birlikte, farelerin sadece% 20 ila% 30’u BA’nın kronik fazına girmiştir; bu, zaman noktası ve anti-Ly6G antikorunun enjeksiyon sayısı ile ilgili olabilir. Başarı oranını artırmak için bu kilit noktayı daha fazla araştırmamız gerekiyor. Ek olarak, sadece Gr-1 + hücrelerinin değil, aynı zamanda NK hücreleri, T hücreleri, B hücreleri ve makrofajlar gibi diğer bağışıklık hücrelerinin de önemli roller oynayabileceğini düşünüyoruz.

Protokole gelince, bazı detaylara dikkat edilmesi gerekiyor. (i) Enjekte edilen ilaçların sızmasını önlemek için, 0.33 mm çapında bir iğne ile 1 mL’lik bir insülin şırıngası kullanıyoruz, çünkü iğne çapı küçüktür ve şırıngaya iğne deliği küçüktür, bu da ilaç sızıntısı olasılığını azaltmaya elverişlidir. (ii) Enjeksiyondan önce, fare hareket etmesini önlemek, ilaç sızıntısını önlemek ve böylece deneysel etkiyi daha da sağlamak için sabitlenmelidir. (iii) İlaç enjeksiyonu sırasında, ilacı fare karaciğerinin yüzeyine veya alt kenarına mümkün olduğunca enjekte ettik, böylece ilaç karnına girdi ve etkili olmak için karaciğere tam olarak temas etti. (iv) Enjeksiyon genellikle farenin sağ üst uyluğundan yapılır, çünkü yenidoğan farenin midesi ve dalağı sol karın bölgesindedir ve mide sütle doludur. İğne sol taraftan sokulursa, mideyi kolayca delebilir, sütün karın içine akmasına neden olabilir veya dalağı delerek kanamaya neden olabilir.

CD177, Ly6G’nin bir homologudur ve BA hastalarında CD177 ekspresyonu araştırılmıştır. CD177, çocuklarda BA’nın erken tanısı için bir belirteç olarak kullanılabilir, bu da CD177+ hücrelerinin BA23 seyrinde önemli bir rol oynadığını gösterir. RNA dizileme verilerini analiz ederek, ekibimiz CD177 hücrelerinin Gr-1 + hücrelerinin baskın popülasyonu olduğunu buldu; Bu arada, RRV ile aşılanan Cd177-/- BALB/ c fareleri, BA’nın gecikmeli bir başlangıcını ve morbidite ve mortaliteyi azalttığını göstermiştir18. Bu nedenle, kronik BA fare modelimiz, BA’nın patogenezini ve hastalık ilerlemesini incelemek için belirgin avantajlara sahiptir; aynı zamanda BA için potansiyel tedavileri incelemek için uygun bir hayvan modeli sağlar.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (81974056) R.Z.’ye ve Çin Ulusal Doğa Gençlik Vakfı’ndan (82101808) ve Guangzhou Bilim ve Teknoloji Planlama Projesi’nden (No. 202102020196) Z.L.’ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

Materials

Balb/c mouse Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD 20221000112
rat anti-mouse Ly6G Bio X Cell clone 1A8 West Lebanon, NH
rat anti-mouse cytokeratin 19 Developmental Studies Hybridoma Bank clone TROMA III Iowa City, IA
rat anti-mouse F4/80 R&D Systems MAB5580 Minneapolis, MN
RRV strain  ATCC MMU 18006 Manassas, VA
Fluorescent stereomicroscope Olympus SZX7
Leica light microscopy Leica Microsystems Leica DMI8+DFC7000T Wetzlar, Germany
Hitachi Pre-Analytical Process Automation System Hitachi 7600 Clinical Analyzer Tokyo, Japan
Isoflurane anesthetic RWD R510-22-10
Rhodamine 123 Sigma-Aldrich 83702
sirius red dye Leagene DC0041
paraffin microtome Leica Microsystems RM2235
neutral gum Solarbio G8590
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Lakshminarayanan, B., Davenport, M. Biliary atresia: A comprehensive review. Journal of Autoimmunity. 73, 1-9 (2016).
  2. Bassett, M. D., Murray, K. F. Biliary atresia: Recent progress. Journal of Clinical Gastroenterology. 42 (6), 720-729 (2008).
  3. Bezerra, J. A., et al. Biliary atresia: Clinical and research challenges for the twenty-first century. Hepatology. 68 (3), 1163-1173 (2018).
  4. Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. Biliary atresia. Lancet. 374 (9702), 1704-1713 (2009).
  5. Lee, W. S., Looi, L. M. Usefulness of a scoring system in the interpretation of histology in neonatal cholestasis. World Journal of Gastroenterology. 15 (42), 5326-5333 (2009).
  6. Russo, P., et al. Key histopathologic features of liver biopsies that distinguish biliary atresia from other causes of infantile cholestasis and their correlation with outcome: A multicenter study. The American Journal of Surgical Pathology. 40 (12), 1601-1615 (2016).
  7. Fickert, P., et al. Characterization of animal models for primary sclerosing cholangitis (PSC). Journal of Hepatology. 60 (6), 1290-1303 (2014).
  8. Sonoda, S., et al. Biliary atresia-specific deciduous pulp stem cells feature biliary deficiency. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 582 (2021).
  9. Xiao, Y., et al. Long noncoding RNA H19 contributes to cholangiocyte proliferation and cholestatic liver fibrosis in biliary atresia. Hepatology. 70 (5), 1658-1673 (2019).
  10. Desmet, V. J., Krstulović, B., Van Damme, B. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
  11. Luo, Z., Shivakumar, P., Mourya, R., Gutta, S., Bezerra, J. A. Gene expression signatures associated with survival times of pediatric patients with biliary atresia identify potential therapeutic agents. Gastroenterology. 157 (4), 1138-1152 (2019).
  12. Mariotti, V., Strazzabosco, M., Fabris, L., Calvisi, D. F. Animal models of biliary injury and altered bile acid metabolism. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1254-1261 (2018).
  13. Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40 (1), 35-48 (2008).
  14. McDermott, A. J., et al. The role of Gr-1(+) cells and tumour necrosis factor-α signalling during Clostridium difficile colitis in mice. Immunology. 144 (4), 704-716 (2015).
  15. Zhang, R., et al. The role of neonatal Gr-1(+) myeloid cells in a murine model of rhesus-rotavirus-induced biliary atresia. The American Journal of Pathology. 188 (11), 2617-2628 (2018).
  16. Fu, M., et al. A silver nanoparticle method for ameliorating biliary atresia syndrome in mice. Journal of Visualized Experiments. (140), e58158 (2018).
  17. Sy, J., Ang, L. C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Methods in Molecular Biology. 1897, 269-278 (2019).
  18. Zhang, R., et al. CD177(+) cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia. Journal of Hepatology. 77 (5), 1299-1310 (2022).
  19. Engel, D. R., et al. CX3CR1 reduces kidney fibrosis by inhibiting local proliferation of profibrotic macrophages. Journal of Immunology. 194 (4), 1628-1638 (2015).
  20. Liang, M., et al. A modified murine model of systemic sclerosis: Bleomycin given by pump infusion induced skin and pulmonary inflammation and fibrosis. Laboratory Investigation. 95 (3), 342-350 (2015).
  21. Chen, Y., et al. Differential effects of sorafenib on liver versus tumor fibrosis mediated by stromal-derived factor 1 alpha/C-X-C receptor type 4 axis and myeloid differentiation antigen-positive myeloid cell infiltration in mice. Hepatology. 59 (4), 1435-1447 (2014).
  22. Tomasson, M. H., et al. Fatal myeloproliferation, induced in mice by TEL/PDGFbetaR expression, depends on PDGFbetaR tyrosines 579/581. Journal of Clinical Investigation. 105 (4), 423-432 (2000).
  23. Zhang, R., Huang, J., Shan, J., Chen, Y., Xia, H. Peripheral blood CD177(+) cells as an early diagnostic marker for biliary atresia: A prospective multicentre study in pediatric patients with cholestasis. Journal of Hepatology. 77 (6), 1714-1716 (2022).

Tags

Mouse ModelChronic Liver FibrosisBiliary AtresiaRhesus RotavirusAnti-Ly6G AntibodyIntraperitoneal InjectionLiver FunctionFluorescent DyeGallbladderExtrahepatic Bile Ducts

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Wang, X., Zhang, R., Lin, Z., Fu, M., Chen, Y. A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia. J. Vis. Exp. (192), e65044, doi:10.3791/65044 (2023).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image