कई छोटे जीवों से स्वचालित मल्टीमॉडल उत्तेजना और एक साथ न्यूरोनल रिकॉर्डिंग
Summary
हम लचीले रासायनिक और मल्टीमॉडल उत्तेजना और कई केनोरहाब्डिस एलिगेंस कीड़े से एक साथ तंत्रिका गतिविधि की रिकॉर्डिंग के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। यह विधि माइक्रोफ्लुइडिक्स, ओपन-सोर्स हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर का उपयोग करती है, और अनुकूलन, अस्थायी निषेध और उत्तेजना क्रॉसस्टॉक जैसे न्यूरोनल घटनाओं के माप को सक्षम करने के लिए स्वचालित डेटा विश्लेषण की देखरेख करती है।
Abstract
फ्लोरोसेंट आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों ने व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के स्तर से पूरे मस्तिष्क सर्किट तक तंत्रिका गतिशीलता की हमारी समझ में बहुत योगदान दिया है। हालांकि, तंत्रिका प्रतिक्रियाएं पूर्व अनुभव, आंतरिक अवस्थाओं, या स्टोकेस्टिक कारकों के कारण भिन्न हो सकती हैं, इस प्रकार उन तरीकों की आवश्यकता उत्पन्न होती है जो एक बार में कई व्यक्तियों में तंत्रिका समारोह का आकलन कर सकते हैं। जबकि अधिकांश रिकॉर्डिंग तकनीक एक समय में एक ही जानवर की जांच करती है, हम एक बार में दर्जनों केनोरहाब्डिस एलिगेंस या अन्य उप-मिलीमीटर-स्केल जीवों को न्यूरोनल रिकॉर्डिंग को स्केल करने के लिए वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी के उपयोग का वर्णन करते हैं। ओपन-सोर्स हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर प्रोग्रामिंग में पूरी तरह से स्वचालित प्रयोगों में बहुत लचीलापन देते हैं जो रासायनिक, ऑप्टिकल, यांत्रिक, थर्मल और विद्युत चुम्बकीय उत्तेजनाओं सहित विभिन्न उत्तेजना प्रकारों की तीव्रता और समय को नियंत्रित करते हैं। विशेष रूप से, माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह उपकरण उप-सेकंड समय संकल्प के साथ केमोसेंसरी उत्तेजनाओं का सटीक, दोहराने योग्य और मात्रात्मक नियंत्रण प्रदान करते हैं। न्यूरोट्रैकर अर्ध-स्वचालित डेटा विश्लेषण पाइपलाइन तब तंत्रिका उत्तेजना और गतिशीलता में कार्यात्मक परिवर्तनों को उजागर करने के लिए व्यक्तिगत और जनसंख्या-व्यापी तंत्रिका प्रतिक्रियाओं को निकालती है। यह पेपर न्यूरोनल अनुकूलन, अस्थायी निषेध और उत्तेजना क्रॉसस्टॉक को मापने के उदाहरण प्रस्तुत करता है। ये तकनीकें उत्तेजना की सटीकता और पुनरावृत्ति को बढ़ाती हैं, जनसंख्या परिवर्तनशीलता की खोज की अनुमति देती हैं, और कोशिकाओं और ऑर्गेनोइड्स से पूरे जीवों और पौधों तक छोटे बायोसिस्टम में अन्य गतिशील फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए सामान्य हैं।
Introduction
कैल्शियम इमेजिंग तकनीकों ने प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करके वास्तविक समय में विवो तंत्रिका गतिशीलता में गैर-आक्रामक रिकॉर्डिंग की अनुमति दी है जो लक्ष्य कोशिकाओं 1,2,3 में व्यक्त किए गए हैं। ये सेंसर आमतौर पर एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) का उपयोग करते हैं, जैसे जीएफपी-शांतोडुलिन-एम 13 पेप्टाइड (जीसीएएमपी) परिवार, न्यूरोनल सक्रियण और ऊंचा इंट्रासेल्युलर कैल्शियम के स्तर पर प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ाने के लिए। कैल्शियम इमेजिंग नेमाटोड सी एलिगेंस में विशेष रूप से शक्तिशाली रही है ताकि यह जांचा जा सके कि न्यूरॉन्स और तंत्रिका सर्किट जीवित रहने में कैसे कार्य करते हैं, जानवरों को 4,5,6,7,8,9,10, क्योंकि उनकी पारदर्शी प्रकृति का मतलब है कि ऑप्टिकल पहुंच के लिए कोई शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की आवश्यकता नहीं है, और सेल-विशिष्ट जीन प्रमोटर रुचि की कोशिकाओं को लक्षित करते हैं। ये तकनीकें अक्सर माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करती हैं, जो11,12 के छोटे भौतिक पैमाने पर जैविक, रासायनिक और भौतिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए सटीक नियंत्रित वातावरण प्रदान करती हैं। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण तंत्रिका गतिविधि को मापने के लिए प्रचुर मात्रा में हैं, नए डिजाइन लगातार विकास के अधीन हैं, और वे अनुसंधान प्रयोगशाला में आसानी से निर्मित हैं। हालांकि, कई डिजाइन एक समय में एक ही जानवर को फंसाते हैं, प्रयोगात्मक थ्रूपुट 7,9,13 को सीमित करते हैं। तंत्रिका प्रतिक्रियाएं अक्सर पूर्व अनुभव, तनाव या भूख जैसी आंतरिक अवस्थाओं या जीन अभिव्यक्ति स्तर जैसे स्टोकेस्टिक कारकों में अंतर के कारण जानवरों में काफी भिन्न होती हैं। ये अंतर उन तरीकों की आवश्यकता को स्थापित करते हैं जो एक साथ कई जानवरों को उत्तेजित और निरीक्षण कर सकते हैंऔर व्यक्तियों से जानकारी निकाल सकते हैं।
इसके अलावा, कुछ न्यूरोमोडुलेटरी घटनाएं केवल विशिष्ट उत्तेजना स्थितियों के तहत स्पष्ट हो जाती हैं, जैसे कि अस्थायी निषेध14, जो प्रतिक्रियाओं के संक्षिप्त दमन को संदर्भित करता है जब उत्तेजना तेजी से होती है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम इस उद्देश्य के लिए एक व्यापक उत्तेजना स्थान में तंत्रिका गतिविधि को चला सकते हैं, उदाहरण के लिए, विद्युत पल्स वर्तमान, वोल्टेज, आवृत्ति, तरंग, ड्यूटी चक्र और आवधिक उत्तेजना ट्रेनों के समय को संशोधित कर सकते हैं। स्वाभाविक रूप से पता लगाए गए उत्तेजनाओं या ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम द्वारा अप्रत्यक्ष उत्तेजना नियंत्रण तंत्र की एक समान चौड़ाई से लाभान्वित होगी। वर्तमान में, कई प्राकृतिक उत्तेजनाओं को एक सरल “ऑन-ऑफ” तरीके से प्रस्तुत किया जाता है, जैसे कि गंध प्रस्तुति और हटाने, वाणिज्यिक प्रणालियों का उपयोग करके जो लचीलापन जोड़ने के लिए धीमा रहे हैं। हालांकि, सस्ती माइक्रोकंट्रोलर अब कई प्रकार की उत्तेजनाओं के वितरण को इस तरह से स्वचालित कर सकते हैं जो शोधकर्ताओं की आवश्यकताओं के लिए अनुकूलन योग्य है। माइक्रोफ्लुइडिक्स के साथ संयुक्त, इन प्रणालियों ने प्रयोगात्मक थ्रूपुट और लचीलेपन में वृद्धि के लक्ष्य को प्राप्त किया है, जिससेकई जानवरों में एक साथ विभिन्न सटीक उत्तेजनाओं के लिए तंत्रिका प्रतिक्रियाओं को मापा जा सकता है। मल्टीमॉडल उत्तेजना का उपयोग न्यूरोनल सर्किटरी से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि ड्रग एक्सपोजर4 जैसे ऑर्थोगोनल गड़बड़ी से पहले, दौरान और बाद में लगातार उत्तेजित होने पर तंत्रिका उत्तेजना में परिवर्तन की निगरानी करके। वैज्ञानिक अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए सस्ती, खुली माइक्रोस्कोपी प्रणालियों के लाभ स्पष्ट हैं, फिर भी व्यवहार में, पार्ट सोर्सिंग, निर्माण और प्रदर्शन सत्यापन की आवश्यकता इन तकनीकों को अपनाने में बाधा डाल सकती है।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य इन तकनीकी चुनौतियों में से कुछ को कम करना है। जबकि पिछले प्रोटोकॉल ने माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस उपयोग और बुनियादी उत्तेजना9,15,17 पर ध्यान केंद्रित किया है, हम यहां सी एलिगेंस या अन्य छोटे जीवों में तंत्रिका इमेजिंग के लिए एक लचीली, स्वचालित, मल्टीमॉडल उत्तेजना वितरण प्रणाली के निर्माण और उपयोग का वर्णन करते हैं। ओपन-सोर्स सिस्टम को प्रयोगों को परिभाषित करने के लिए सरल टेक्स्ट फ़ाइलों के माध्यम से प्रोग्राम किया जाता है, और न्यूरोट्रैकर डेटा विश्लेषण प्रोग्राम अर्ध-स्वचालित रूप से माइक्रोस्कोप वीडियो से तंत्रिका गतिविधि डेटा निकालता है। हम इस प्रणाली को केमोसेंसरी न्यूरॉन एडब्ल्यूए का उपयोग करके अस्थायी निषेध, विघटन और उत्तेजना क्रॉसस्टॉक का आकलन करने के उदाहरणों के साथ प्रदर्शित करते हैं, जो ऑप्टोजेनेटिक प्रकाश-संवेदनशील आयन चैनल 5,6 को व्यक्त करते समय विभिन्न खाद्य गंधों के जवाब में या प्रकाश के जवाब में विध्रुवीकृत होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम विभिन्न उत्तेजना पैटर्न के अस्थायी रूप से सटीक वितरण का उपयोग करके तंत्रिका गतिविधि की घटनाओं के मूल्यांकन के लिए एक ओपन-एक्सेस माइक्रोस्कोपी प्रणाली का वर्णन करते हैं। माइक्रोफ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इन प्रोटोकॉल का परीक्षण करने और पांडुलिपि की समीक्षा करने और प्रोग्रामिंग सहायता के लिए एरिक हॉल के लिए फॉक्स एवरी को धन्यवाद देते हैं। यहां प्रस्तुत विधियों के लिए वित्त पोषण राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन 1724026 (डीआरए) द्वारा प्रदान किया गया था।
Materials
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
Referências
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