ATAC-Seq spécifique aux adipocytes avec tissus adipeux par tri des noyaux activés par fluorescence

Le tissu adipeux, spécialisé dans le stockage de l’excès d’énergie sous forme de molécules lipidiques, est un organe clé pour la régulation métabolique. Le contrôle strict de la formation et du maintien des adipocytes est vital pour la fonction du tissu adipeux et l’homéostasie énergétique du corps entier¹. De nombreux régulateurs transcriptionnels jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la différenciation, de la plasticité et de la fonction des adipocytes ; Certains de ces régulateurs sont impliqués dans les troubles métaboliques chez l’homme ^2,3. Les progrès récents dans les techniques de séquençage à haut débit pour l’expression génique et l’analyse épigénomique ont encore facilité la découverte des régulateurs moléculaires de la biologie des adipocytes⁴. Les études de profilage moléculaire utilisant des tissus adipeux sont difficiles à mener en raison de l’hétérogénéité de ces tissus. Le tissu adipeux se compose principalement d’adipocytes, qui sont responsables du stockage des graisses, mais contient également divers autres types de cellules, telles que les fibroblastes, les cellules endothéliales et les cellules immunitaires⁵. De plus, la composition cellulaire du tissu adipeux est considérablement modifiée en réponse à des changements physiopathologiques tels que la température et l’état nutritionnel⁶. Pour surmonter ces problèmes, nous avons précédemment développé une souris rapporteur transgénique, appelée Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), qui produit des ribosomes marqués GFP et des noyaux biotinylés marqués mCherry d’une manière dépendante de la recombinase^{Cre 7}. Le système de double marquage permet d’effectuer des analyses transcriptomiques et épigénomiques spécifiques au type cellulaire avec des tissus. En utilisant des souris NuTRAP croisées avec des lignées adiponectine-Cre spécifiques aux adipocytes (Adipoq-NuTRAP), nous avons précédemment caractérisé les profils d’expression génique et les états de chromatine des populations d’adipocytes purs in vivo et déterminé comment ils sont modifiés pendant l’obésité ^7,8. Auparavant, des souris NuTRAP croisées avec des lignées Ucp1-Cre spécifiques aux adipocytes bruns et beiges (Ucp1-NuTRAP) nous ont permis de caractériser le remodelage épigénomique de la rare population d’adipocytes thermogéniques, les adipocytes beiges, en réponse aux changements de température⁹.

ATAC-seq est une méthode analytique largement utilisée pour évaluer l’accessibilité de la chromatine à l’échelle du génome. La transposase Tn5 hyper-réactive utilisée dans ATAC-seq permet l’identification de régions ouvertes de chromatine en marquant des adaptateurs de séquençage dans la région accessible à la chromatine des noyaux¹⁰. ATAC-seq est une méthode simple, mais elle fournit des résultats robustes et est très efficace même avec des échantillons à faible entrée. Il est ainsi devenu l’une des méthodes de profilage épigénomique les plus populaires et a contribué à la compréhension des mécanismes de régulation de l’expression génique dans divers contextes biologiques. Depuis la création du protocole ATAC-seq original, diverses techniques dérivées de l’ATAC-seq ont été développées pour modifier et optimiser le protocole pour divers types d’échantillons. Par exemple, Fast-ATAC est conçu pour analyser des échantillons de cellules sanguines¹¹, Omni-ATAC est un protocole optimisé pour les échantillons de tissus congelés 12 et MiniATAC-seq est efficace pour l’analyse embryonnaire à un stade précoce¹³. Cependant, l’application de la méthode ATAC-seq aux adipocytes, en particulier à partir d’échantillons de tissus, reste difficile. En plus de l’hétérogénéité du tissu adipeux, sa teneur élevée en lipides peut interférer avec des réactions de recombinaison efficaces par la transposase Tn5 même après isolement du noyau. En outre, la teneur mitochondriale élevée dans les adipocytes, en particulier dans les adipocytes bruns et beiges, provoque une contamination élevée de l’ADN mitochondrial et des lectures de séquençage gaspillées. Cet article décrit un protocole pour le séquençage ATAC spécifique des adipocytes utilisant des souris Adipoq-NuTRAP (Figure 1). En tirant parti du tri des noyaux marqués par fluorescence, ce protocole permet la collecte de populations pures de noyaux adipocytaires loin des autres types de cellules confondantes et l’élimination efficace des lipides, des mitochondries et des débris tissulaires. Par conséquent, ce protocole peut générer des données de haute qualité spécifiques au type de cellule et minimiser les déchets des lectures mitochondriales tout en utilisant une quantité réduite d’entrées et de réactifs par rapport au protocole standard.