成体ショウジョウバエメラノガスターにおける化学毒性の評価

注意: このプロトコルのすべてのステップでニトリル手袋を着用してください。評価された各化学物質の安全データシートに従って、白衣、目の保護具、および/または呼吸用保護具を着用してください。 1.バイアルおよび湿度チャンバーの準備 注意: 手順1.1〜1.5は、他の実験セクションを開始する前にいつでも完了できます。ニトリル手袋は、汚染を防ぐためにバイアル調製中は常に着用する必要があります。 グレード1セルロースクロマトグラフィー紙( 材料表を参照)を4枚積み重ね、幅の広いストリップに2つにカットします。花の形のダイを含む1.5インチのペーパーパンチを使用して、花の形のろ紙インサートを打ち抜きます。 22 mm x 220 mmのニスを塗っていない木製ダボを使用して、ろ紙を直径28.5 mmのポリプロピレンバイアルの底に押し込みます。ろ紙のスタックがバイアルの底にしっかりと配置されていることを確認します。 準備したバイアルをプラスチックまたは段ボールのトレイに保管し、トレイを使用するまで大きな(~280 mm x 240 mm)ビニール袋に入れます。 606.24 mm x 225.42 mm x 403.22 mmのプラスチック製浴槽のプラスチック蓋に120 mm x 280 mmの穴を開けて、湿度チャンバーを構築します( 材料表を参照)。空気の流れを可能にするために穴の上にメッシュを接着します。 ルーバー付きシーリングライトパネル(元々は610 mm x 1220 mm)からプラスチックグリッドの一部を切り取り、手順1.4で使用したプラスチック製の浴槽の底に収まります。注意: さまざまなプラスチック浴槽とプラスチック/金属グリッド材料を使用して、湿度チャンバーを構築できます。 2.フライ飼育 標準的なブルーミントン ショウジョウバエ ストックセンター(BDSC)培地31を含むガラスミルクボトルで成虫のハエ(最低30匹の成虫)の培養を開始します。繊細なタスクワイプで包まれたレーヨンプラグでボトルを閉じます。ボトルを混雑させないでください。注:必要なボトルの数は、実施されている化学物質への曝露の数と試験株の遺伝子型によって異なります。通常、丈夫で繁殖力のあるストックを使用すると、1本のボトルから数百匹のハエを得ることができます。標準アッセイではOregon-R野生型ハエ(BDSC stock #2057)を使用しますが、このプロトコルでは目的の遺伝子型を使用できます。繁殖力および/または生存率が低い遺伝子型が損なわれると、ボトル培養を増やす必要があることを忘れないでください。 培養ボトルのトレイを25°Cで湿度約60%、明暗サイクル12:12でインキュベートし、3匹目の幼虫期または初期の蛹期が観察されます。この段階は、ボトルの側面をさまよう幼虫の存在とボトルの壁に蛹が現れることによって識別できます。注意: 12:12時間のライト:ダークサイクルのライトオン期間中にのみハエを処理します。堅牢な在庫の場合、ボトルは記載された条件下で3〜4日後にこの段階に達します。成虫のハエを取り除き、メディアの流動性を判断します。反転したときにメディアがボトルの側面に沿って流れる場合、メディアは流動性が高すぎます。繊細なタスクワイプまたはレーヨンボールをボトルの底に挿入して、フライフードを固めます。 ハエが閉じ始めたら、すべての成虫をボトルから取り除き、蛹が48時間閉じ続けるようにします。この時点で、培養ボトルから除去された成虫は、ストックを繁殖させるために新しいボトルに移すか(ステップ2.1を参照)、廃棄することができます。 48時間以内に閉じ込められたハエを、標準のBDSC培地を含む新しいボトルに移します。3日間の年齢。注:これらのボトルの成虫は生後3〜5日で、致死率と摂食実験に使用できます。成虫のハエを老化させるために使用されるボトルには、卵と幼虫が含まれます。その結果、これらのボトルは次世代のハエを繁殖させるために使用することができます。 3.化学物質暴露のためのハエの準備 5〜7日齢の麻酔はCO2で飛ぶ。麻酔をかけたハエを性器を使って性別で分類します。ハエの麻酔と性別の支援については、参考文献28を参照してください。 20匹のオスまたは20匹のメスのハエのグループを、標準的なBDSC培地を含むバイアルに入れます。レーヨンプラグでバイアルを閉じ、オスバイアルとメスバイアルを別々に保管します。雌のハエを含むバイアルに縞模様の印を付けます。誤って性別が混ざらないように、オスのハエが入ったバイアルにマークを付けないでください。注:ステップ3.2で調製する必要のあるバイアルの数は、暴露実験のサイズによって決まります。ステップ5.3および5.6で説明したように、単一の試験化学物質の一般的な距離測定実験には、少なくとも40バイアルのオスと40バイアルのメスが必要です。ステップ7.4および7.8で説明されている標準的な用量反応曲線実験には、少なくとも63バイアルの男性と63バイアルの女性が必要です。. バイアルをインキュベーターに48時間保管し、湿度約60%の25°Cで、12:12時間の明暗サイクルで保管します。この間、麻酔から回復している間、ハエが食べ物に詰まるのを防ぐために、選別されたバイアルのトレイを60°の角度で支えます。注:このステップにより、ハエはCO2 麻酔から回復することができます。曝露プロトコルの残りの間、ハエを再度麻酔しないでください。 48時間の回収期間の後、ステップ1.3で調製したバイアルに0.75 mLの滅菌精製水を追加します。このステップで準備するバイアルの数は、ステップ3.2で設定したバイアルの数と同じである必要があります。 ステップ3.2のハエを含むガラスバイアルを開き、準備したプラスチックバイアルの口に入れ、プラスチックバイアルの底をベンチトップに軽くたたくことにより、選別された性別一致のハエを飢餓バイアルに移します。セルロースアセテートプラグ(一般にフラッグとして知られている)でプラスチックバイアルを閉じます。この転送で失われたハエを記録します(後で各バイアルの開始ハエ数のレコードに転送します)。 雌のハエを含む飢餓バイアルを縞模様でマークします。誤って性別が混ざらないように、オスのハエが入ったバイアルにマークを付けないでください。 一晩さらすために湿度チャンバーを準備します。このチャンバーの構築方法については、手順1.4〜1.5を参照してください。湿度チャンバーの底に6枚の標準的なペーパータオルを置きます。ペーパータオルを100mLの水に浸します。 プラスチックグリッド(ステップ1.5)を濡れたタオルの上に置き、バイアルが飽和したペーパータオルに接触しないようにします。 飢餓バイアルのトレイを湿度チャンバー内の水平位置に置きます。湿度チャンバーを25°Cのインキュベーター(湿度約60%)に一晩置きます。注:理想的には、一晩の飢餓期間は約16時間続きます。ただし、タイミングは個々のラボのスケジュールに合わせて調整できます。 4. 原液の調製 注:ハエは、酵母-スクロース液体培地でテスト化学物質を与えられます。このセクションでは、濃縮供給媒体とテスト薬品のストック溶液の調製について説明します。 滅菌精製水に溶解した4%スクロースと16%酵母エキス(m / v)を含む6x酵母-スクロース溶液を調製します( 材料の表を参照)。溶液を適切な滅菌時間(例えば、1Lで40分)液体サイクルでオートクレーブする。注:溶液はバルクで作成し、-20°Cでアリコートで保存できます。 個々のアリコートは、使用の1日前に4°Cの冷蔵庫に入れて解凍します。 試験化学物質の在庫を準備します。最初の実験では、化学物質が水に完全に溶解できるように、原液は最高濃度で作られるべきです。注意: 水以外の溶媒を使用して、試験化学物質を溶解することができます。代替溶媒の使用に関する注意事項に関する説明を参照してください。 1 gのFD&C Blue No. 1( 材料表を参照)を10 mLの滅菌精製水に溶解して、100倍の青色色素原液を調製します。注:青色染料ストック溶液はバルクで作成し、4°Cでアリコートで保存できます。 5.露光バイアルの調製:距離探索実験 注:プロトコルのステップ5および6は、100%の致死性を誘発する試験化学物質の最低用量と、致命的な表現型を誘発できない最高用量を特定するように設計されています。これらの濃度が以前の実験によってすでに決定されている場合は、用量反応曲線を計算するためのステップ7および8を参照してください。露光媒体は、露光バイアルにハエを添加する直前に調製する必要があります。 8本の15 mL遠沈管に、(i)化学薬品なし、(ii)最高濃度、(iii)1:2、1:10、1:20、1:100、1:200、および1:1,000のラベルを付けます。 最初に2.5 mLの4x酵母/スクロースストック溶液を8つの標識チューブすべてに追加することにより、ステップ5.1の標識遠心チューブで曝露培地を準備します。「化学薬品なし」とラベル付けされたチューブに7.5 mLの滅菌精製水を追加します。この希釈が陰性対照である。 7.4 mLの試験薬品原液を「最高濃度」とラベル付けされたチューブに追加します。このチューブに100 μLの滅菌精製水を加えると、最終的な容量は10 mLになります。この溶液中の試験化学物質のモル濃度を計算して記録します。注:チューブに100μLの滅菌精製水を添加すると、このステップの化学物質濃度は、給餌行動を評価する方法として青色染料ストック溶液を露光媒体に添加するステップ5.5で使用される濃度と同じになります。 残りのチューブに適量の試験薬品原液と滅菌精製水を加えます。各チューブの最終容量は10mLでなければなりません。「最高濃度」チューブに対するこれらのチューブ内の試験化学物質の最終濃度は、1:2、1:10、1:20、1:100、1:200、および1:1,000である必要があります。 ステップ5.1で生成された露光媒体の個々の濃度ごとに8つの露光バイアルを準備し、ラベルを付けます。次のラベルを含む8セットのバイアル(合計64バイアル)が必要です:化学物質なし、最高濃度、1:2、1:10、1:20、1:100、および1:1,000。ステップ5.2.3で調製した0.75mLの露光媒体を対応する曝露バイアルのセットにピペットで入れます。 8本の5 mL個別チューブに、(i)化学薬品なし、(ii)最高濃度、(iii)1:2、1:10、1:20、1:100、1:200、および1:1,000のラベルを付けます。 最初に500 μLの4x酵母/スクロースストック溶液と20 μLの青色染料ストック溶液を8本の標識5 mLチューブで混合することにより、青色色素露光培地を調製します。1.48 mLの滅菌精製水を「化学薬品なし」とラベル付けされたチューブに追加します。この希釈が陰性対照である。 1.48 mLの試験薬品原液を「最高濃度」とラベル付けされたチューブに追加します。このチューブには水は追加されていません。この溶液中の試験化学物質のモル濃度を計算して記録します。 残りのチューブに適量の試験薬品原液と滅菌精製水を加えます。各チューブの最終容量は2 mlです。「最高濃度」チューブに対するこれらのチューブ内の試験化学物質の最終濃度は、1:2、1:10、1:20、1:100、1:200、および1:1,000である必要があります。 2つの露光バイアルを準備し、青色露光媒体の個々の濃度でラベル付けします。次のラベルを含む8セットのバイアル(合計16バイアル)が必要です:化学物質なし、最高濃度、1:2、1:10、1:20、1:200、および1:1,000。「青」という言葉もこれらのバイアルに書かれるべきです。0.75 mLの青色露光媒体を対応する青色露光バイアルのセットにピペットで入れます。 6.フライ化学物質への暴露:距離探索実験 次のように、ステップ3.7の一晩飢えたハエのバイアルを使用して化学物質暴露バイアルを準備します。飢えた雌のハエの4つのバイアル(バイアルあたり20匹のハエ)を各化学濃度の4つの曝露バイアルに移します。これらのバイアルに「女性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。 飢えたオスのハエの4つのバイアル(バイアルあたり20匹のハエ)を各化学濃度の4つの曝露バイアルに移します。これらのバイアルに「男性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。 次のように、ステップ3.7の一晩飢えたハエのバイアルを使用して、青色染料を含む化学物質暴露バイアルを準備します。飢えた雌のハエのバイアル1本(バイアルあたり20匹のハエ)を、化学物質濃度ごとに1本の青色暴露バイアルに移します。このバイアルに「女性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。 飢えたオスのハエのバイアル1本(バイアルあたり20匹のハエ)を、化学物質濃度ごとに1つの青色暴露バイアルに移します。このバイアルに「男性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。 転送後に各バイアルに存在するハエの数を記録し、死亡または脱出した数をメモします。通常、20匹のハエはすべて一晩の飢餓と移動を生き残るはずです。 露出バイアルを新たに準備した湿度チャンバーに水平に置きます(湿度チャンバーの準備については、手順3.6を参照)。チャンバーを湿度約60%、明暗サイクル12:12の25°Cのインキュベーターに入れます。 化学物質暴露の開始後24時間および48時間に暴露バイアルを調べます。各時点で各バイアル内の死んだハエの数を数えて記録します。注:このアッセイの読み出しとして死が使用されますが、プロトコルは他の表現型を調べるように適合させることができます。暴露されたハエは、トランスクリプトームおよびメタボローム研究のためにこれらの時点で一般的に収集されます。 化学暴露開始後24時間で青色暴露バイアルを調べます。次の手法を使用して、曝露されたハエが青色の露光媒体を消費したかどうかを判断します。バイアルの壁を調べて、暴露バイアルの側面とフラッグに小さな点として現れる青い糞の兆候がないか調べます。 ハエをCO2 で麻酔し、腹部に青い染料が存在するかどうかを調べます。注:通常、青色露光バイアルは24時間後に分析されます。ただし、この手順は代わりに48時間で実行できます。通常食べたハエは腹部に青い縞模様があり、曝露媒体が腸に入ったことを示しています。 逆流、作物の膨張、腸のバリア機能の崩壊などの異常な摂食行動についてハエを調べます(一般にスマーフィングと呼ばれる消化管だけでなく、生物全体に青い染料が現れることによって示されます32,33)。 汚染されたすべてのバイアル、ろ紙、フラッグ、およびハエは、適切な化学廃棄物容器に廃棄します。生きたハエがバイアルに残っている場合は、適切な廃棄物容器に捨てる前に、バイアルを凍結してハエを殺します。注:暴露バイアルとハエの廃棄は、実験で分析される化学物質によって決まります。化学物質安全データシートに記載されている化学物質安全手順に常に従ってください。距離探索実験で使用された濃度が最低用量でハエを殺す場合は、100%の動物を殺した最低濃度から始めて、希釈シリーズを使用してセクション6を繰り返します。 7.曝露バイアルの調製:用量反応曲線の生成 注:ステップ5および6で概説されているプロトコルは、表現型を引き出すために必要な化学物質濃度を広く決定するように設計されています。プロトコルのステップ7および8は、正確な用量反応曲線を計算するために使用される。 次の方法を使用して、線量反応曲線を生成するために分析する必要があるテスト化学物質濃度を計算します。48時間で暴露されたハエの100%を殺す試験化学物質の最低濃度を決定します。 48時間で生存率に影響を与えない試験化学物質の最高濃度を決定します。 ステップ7.1.1と7.1.2で決定された濃度の間で均等に分布する追加の4つの濃度を計算します。 9本の個別の15 mL遠沈管に、(i)化学物質なし、(ii)ステップ7.1.1で決定された濃度、(iii)ステップ7.1.2で決定された濃度、(iv)7.1.3で決定された濃度、(v)ステップ7.1.1で決定された濃度の2倍、(vi)ステップ7.1.2で決定された濃度の1:2希釈。注:7.1.1で決定された濃度の2倍の濃度と、ステップ7.1.2で決定された濃度の1:2希釈を含めることは、用量反応曲線を正確に計算するために重要です。. まず、ステップ7.2で調製した9本の標識個体15 mL遠沈管に2.5 mLの4x酵母/スクロースストック溶液を加えて露光培地を調製します。「化学薬品なし」とラベル付けされたチューブに7.5 mLの滅菌精製水を追加します。この希釈が陰性対照である。 残りのチューブに適量の試験薬品原液と滅菌精製水を加えます。各チューブの最終容量は10mLでなければなりません。個々のチューブ内の化学物質の最終濃度は、チューブの外側に書かれている濃度と同じである必要があります。 ステップ7.2で生成された露光媒体の濃度ごとに12本の露光バイアルを準備し、ラベルを付けます。9セットのバイアル(合計108バイアル)が必要です。 0.75 mLの露光媒体を対応する露光バイアルのセットにピペットで入れます。メモ: 手順 7.6 から 7.8 はオプションです。ステップ7.2で準備された試験化学物質濃度が摂食行動に影響しないことがわかっている場合は、これらのステップをスキップできます。 ステップ7.2で使用したのと同じ一連の濃度の青色露光媒体用に9つの異なる5 mLチューブを準備してラベルを付けます。 最初に500 μLの4x酵母/スクロースストック溶液と20 μLの青色染料ストック溶液を混合して、青色色素露光媒体を調製します。1.48 mLの精製滅菌水を「化学薬品なし」とラベル付けされたチューブに追加します。この希釈が陰性対照である。 残りのチューブに適量の試験薬品原液と精製滅菌水を加えます。各チューブの最終容量は2mLでなければなりません。個々のチューブ内の化学物質の最終濃度は、チューブの外側に書かれている濃度と同じである必要があります。 青色露光媒体の個々の濃度ごとに2つの露光バイアルを準備し、ラベルを付けます。9セットのバイアル(合計18バイアル)があり、バイアルの各セットにはステップ7.2にリストされている濃度でラベル付けされている必要があります。「青」という言葉もこれらのバイアルに書かれるべきです。0.75 mLの青色露光媒体を対応する青色露光バイアルのセットにピペットで入れます。 8.フライ化学物質曝露:線量反応曲線の生成 次のように、ステップ3.7の一晩飢えたハエのバイアルを使用して化学物質暴露バイアルを準備します。飢えた雌のハエの6つのバイアル(バイアルあたり20匹のハエ)を各化学濃度の6つの曝露バイアルに移します。これらのバイアルに「女性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。 飢えたオスのハエの6つのバイアル(バイアルあたり20匹のハエ)を各化学濃度の6つの曝露バイアルに移します。これらのバイアルに「男性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。 次のように、ステップ3.7の一晩飢えたハエのバイアルを使用して、青色染料を含む化学物質暴露バイアルを準備します。飢えた雌のハエのバイアル1本(バイアルあたり20匹のハエ)を、化学物質濃度ごとに1本の青色暴露バイアルに移します。このバイアルに「女性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。 飢えたオスのハエのバイアル1本(バイアルあたり20匹のハエ)を、化学物質濃度ごとに1つの青色暴露バイアルに移します。このバイアルに「男性」というラベルを付けます。手順 3.5 で説明したのと同じ転送方法を使用します。 転送後に各バイアルに存在するハエの数を記録します。通常、20匹のハエはすべて一晩の飢餓と移動を生き残る必要がありますが、移動中に死亡または脱出したものが合計から差し引かれるようにします。 露出バイアルを新たに準備した湿度チャンバーに水平に置きます(湿度チャンバーの準備については、手順3.6を参照)。チャンバーを湿度約60%、明暗サイクル12:12の25°Cのインキュベーターに入れます。 化学物質暴露の開始後24時間および48時間に暴露バイアルを調べます。各時点で各バイアル内の死んだハエの数を数えて記録します。 化学暴露開始後24時間で青色暴露バイアルを調べます。ステップ6.6で概説した方法を使用して、摂食行動の変化を評価します。 汚染されたすべてのバイアル、ろ紙、フラッグ、およびハエは、適切な化学廃棄物容器に廃棄します。生きたハエがバイアルに残っている場合は、適切な廃棄物容器に廃棄する前に、バイアルを凍結してハエを殺します。注:暴露バイアルとハエの廃棄は、実験で分析される化学物質によって決まります。化学物質安全データシートに記載されている化学物質安全手順に常に従ってください。 9.用量反応曲線の計算 ベンチマーク線量ソフトウェア(BMDS、バージョン3.2; 材料表を参照)または他の同様のソフトウェアを使用して、データを分析します34。以下では、BMDSソフトウェアを使用したワークフローについて説明します。 BMDS の「データ」 タブ をクリックし、「 新規データ・セットの挿入」をクリックします。データセット内のサンプル数を入力し、[ 二分] をクリックして、[ データセットの作成] をクリックします。各レプリケートをデータセット内の個別の行として入力します。 生成された表の最初の列に線量を入力し、2番目の列にステップ8.3)の前に死亡または失われたハエを除いた開始ハエの数を、3番目の列に化学物質曝露によって死亡したハエの数を入力します。 BMDSの メインタブ をクリックします。 [モデルタイプの選択]メニューの ドロップダウン矢印 をクリックし、[ 二分]をクリックします。 データセットテーブルのステップ 9.2 のデータセットの 有効化 をクリックします。 MLE および代替案の表で、解析 に使用するモデルのボックス をクリックします。注:頻度主義制限二分丘モデルが主に使用されました。 [ 分析の実行] をクリックします。プログラムは、致死率曲線とモデルに関する追加の詳細を含む出力ファイルを生成します。