Modelo post-resección de la recaída del glioblastoma para investigaciones terapéuticas de hidrogel

Todos los experimentos con animales fueron aprobados y supervisados por la Junta de Revisión Institucional y el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Nanjing (IACUC-1904004). Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6J, de 6-8 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). 1. Preparación animal Pesar a los ratones y anestesiarlos con una inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico (ver Tabla de materiales). Administrar meloxicam (5 mg/kg; i.p.) para la analgesia perioperatoria. Aloje a los ratones en una jaula bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h, una temperatura ambiente de 24 °C y una humedad relativa del 50%.NOTA: Para el presente estudio, el peso inicial de los ratones fue de aproximadamente 22 g. Retire el pelo de la cabeza de un ratón con una máquina de afeitar para animales de laboratorio y fije la cabeza y las extremidades en el aparato estereotáxico (consulte la tabla de materiales).NOTA: Esterilice todo el equipo antes de usarlo. Desinfecte la cabeza del ratón con al menos tres rondas alternas de exfoliante de clorhexidina o povidona yodada seguidas de alcohol, y cubra el ratón con un paño quirúrgico estéril. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar que se sequen. Corta el cuero cabelludo del ratón aproximadamente 1 cm a lo largo de la línea media en la parte superior de la frente derecha con unas tijeras oftálmicas.NOTA: Confirme el plano quirúrgico de la anestesia por la ausencia de reflejo pedal antes de realizar la incisión. Ajuste el aparato estereotáxico para asegurarse de que la costura en espiga y la punta de la fontanela frontal estén ubicadas al mismo nivel. 2. Construcción del modelo ortotópico intracraneal de GBM Marque el punto 1 mm hacia el lado frontal de la fontanela frontal, 1,8 mm hacia el lado derecho de la fontanela frontal y 3 mm hacia abajo desde la fontanela frontal con un hisopo de algodón humedecido con violeta de genciana2 (ver Tabla de materiales). Taladre la punta con un mini taladro craneal de 1 mm de diámetro (consulte la Tabla de materiales) para crear un tamaño de poro de aproximadamente 1 mm de diámetro y 1 mm de profundidad. Retire el líquido cefalorraquídeo exudado con un hisopo de algodón estéril. Aspirar 5 μL de suspensión de células tumorales (GL261-Luci, 5 × 105 células suspendidas en 5 μL de PBS) con una microjeringa.NOTA: El GL261-Luci se obtuvo de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Alinee la punta de la aguja de la microjeringa verticalmente con el orificio de perforación del cráneo, insértelo hasta que la punta de la aguja entre en el plano del cráneo durante 3 mm y devuelva la aguja 0,5 mm7. Abra la microjeringa e inyecte a una velocidad de 1 μL/min. Conserve la aguja durante 10 minutos después de la inyección. Retire la microjeringa lentamente y presione el punto de inyección con una bola de algodón seca estéril. Suturar el cuero cabelludo con una sutura quirúrgica no absorbible (10-0, ver Tabla de materiales) y volver a desinfectar la incisión. Vigile la salud del animal y manténgalo en condiciones cálidas. Mueva el ratón de vuelta a la jaula de la carcasa después de que el ratón se despierte. Obtener imágenes del ratón con un sistema de imágenes bioluminiscentes in vivo (ver Tabla de materiales) para detectar el tumor trasplantado en el décimo día después de la portadora del tumor.NOTA: La luciferasa cargada en las células GBM, GL261, se utilizó para la obtención de imágenes bioluminiscentes.Anestesiar al ratón con isoflurano al 1,5% con un caudal de oxígeno de 0,6L/min. Después de confirmar la profundidad de la anestesia a través de la falta de reflejo pedal, inyectar al ratón por vía intraperitoneal fluoresceína de potasio (10 mg/mL, ver Tabla de Materiales) y, 11 s después, realizar la obtención de imágenes bioluminiscentes in vivo . Cuando el valor de fluorescencia alcanza ~5 × 105, el procedimiento es exitoso.NOTA: Anestesiar al animal antes de tomar imágenes. Mantener la anestesia a través del cono de la nariz suministrado con isoflurano vaporizado. Seleccionar los ratones con tumores exitosos para construir el modelo de recaída post-resección de GBM. 3. Construcción del modelo post-resección de recaída GBM Cuando el tamaño del tumor en los ratones modelo de GBM intracraneal ortotópico sea de ~6,5 × 105, seleccione los ratones para el modelo de recaída postoperatoria. Pesar los ratones modelo GBM intracraneales ortotópicos y anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico. Administrar meloxicam (5 mg/kg; i.p.) para la analgesia perioperatoria. Repita el proceso de los pasos 1.2 y 1.5. Separe el tejido del cuero cabelludo y el cráneo, y verifique el orificio de perforación utilizado para construir el modelo ortotópico intracraneal de GBM. Si el orificio se ha curado, identifíquelo usando un aparato estereotáxico y siga el procedimiento mencionado en los pasos 2.1-2.3. Amplíe el diámetro del orificio a 5 mm con un taladro de cráneo y extraiga el líquido cefalorraquídeo exudado con un hisopo de algodón estéril. Enfoca el microscopio en la cabeza del ratón y ajusta la configuración para asegurarte de que el orificio de perforación esté situado en el centro del campo de visión. Cortar las meninges con unas tijeras y extirpar parte del tejido tumoral con una microcureta y un microbisturí bajo el microscopio.NOTA: Con respecto a las meninges, cuando se abre el cráneo, la membrana delgada cercana al tejido cerebral son las meninges. Detenga el sangrado con una gasa estéril y lave la incisión con solución salina fisiológica estéril. Inyectar el hidrogel disponible comercialmente (10 μL, ver Tabla de Materiales) en la cavidad de resección con una jeringa de 1 mL, suturar el cuero cabelludo con una sutura quirúrgica no absorbible (10-0) y desinfectar la incisión nuevamente (Figura 1). Controle la salud del animal y mantenga al ratón caliente. Mueva el ratón de vuelta a la jaula de la carcasa después de que el ratón se despierte. Realizar imágenes bioluminiscentes in vivo para detectar el tumor trasplantado 1 día después para cuantificar el tamaño del tumor residual (Figura 2 y Figura 3). Pesar a los ratones cada 2 días hasta el punto final terminal.NOTA: Para el presente estudio, el criterio de valoración terminal fue el día 30, y los ratones fueron sacrificados mediante una sobredosis de pentobarbital sódico con una inyección intraperitoneal.