TACI: 3 डी कैल्शियम इमेजिंग विश्लेषण के लिए एक इमेजजे प्लगइन
Summary
कैल्शियम इमेजिंग का ट्रैकमेट विश्लेषण (टीएसीआई) 3 डी कैल्शियम इमेजिंग विश्लेषण के लिए एक ओपन-सोर्स इमेजजे प्लगइन है जो जेड-अक्ष पर गति की जांच करता है और संबंधित समय बिंदु पर सेल की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रत्येक जेड-स्टैक के अधिकतम मूल्य की पहचान करता है। यह पार्श्व (x / y) दिशा में अतिव्यापी न्यूरॉन्स को अलग कर सकता है लेकिन विभिन्न z-विमानों पर।
Abstract
न्यूरोसाइंस में अनुसंधान डेटा सेट से व्यापक जानकारी निकालने के लिए जटिल इमेजिंग और कम्प्यूटेशनल टूल का उपयोग करने के लिए विकसित हुआ है। कैल्शियम इमेजिंग एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है जिसे विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए परिष्कृत सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है, लेकिन कई प्रयोगशालाएं आधुनिक मानकों को पूरा करने के लिए प्रोटोकॉल को अपडेट करते समय कम्प्यूटेशनल तरीकों को अपनाने के लिए संघर्ष करती हैं। सॉफ्टवेयर के लिए प्रोग्रामिंग ज्ञान और पेवॉल की कमी के कारण कठिनाइयां उत्पन्न होती हैं। इसके अलावा, कैल्शियम इमेजिंग के दौरान रुचि की कोशिकाएं सभी दिशाओं में आंदोलनों को प्रदर्शित करती हैं। पार्श्व (x/y) दिशा में गति को ठीक करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं।
यह पेपर 3 डी कैल्शियम इमेजिंग में जेड-अक्ष पर गति की जांच करने के लिए एक नए इमेजजे प्लगइन, ट्रैकमेट एनालिसिस ऑफ कैल्शियम इमेजिंग (टीएसीआई) का उपयोग करके एक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। यह सॉफ्टवेयर एक न्यूरॉन के सभी जेड-पदों से अधिकतम प्रतिदीप्ति मूल्य की पहचान करता है और इसका उपयोग संबंधित टी-स्थिति में न्यूरॉन की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने के लिए करता है। इसलिए, यह उपकरण पार्श्व (एक्स / वाई) दिशा में अतिव्यापी न्यूरॉन्स को अलग कर सकता है लेकिन अलग-अलग जेड-प्लेन पर दिखाई देता है। इमेजजे प्लगइन के रूप में, टीएसीआई 3 डी कैल्शियम इमेजिंग विश्लेषण के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल, ओपन-सोर्स कम्प्यूटेशनल टूल है। हमने फ्लाई लार्वा थर्मोसेंसिटिव न्यूरॉन्स का उपयोग करके इस वर्कफ़्लो को मान्य किया जो तापमान में उतार-चढ़ाव के दौरान सभी दिशाओं में आंदोलनों को प्रदर्शित करते थे और फ्लाई ब्रेन से प्राप्त 3 डी कैल्शियम इमेजिंग डेटासेट।
Introduction
इंट्रासेल्युलर कैल्शियम का स्तर न्यूरोनल उत्तेजना का एक सटीक मार्कर है। कैल्शियम इमेजिंग न्यूरोनल गतिविधि को समझने के लिए इंट्रासेल्युलर कैल्शियम में परिवर्तन कोमापता है 1. न्यूरोसाइंस में अध्ययन ने इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता को मापने के लिए तकनीकों के विकास के कारण इस पद्धति का तेजी से उपयोग किया है, जिसमें आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई), जैसे जीसीएएमपी 2,3 शामिल हैं, जिन्हें आनुवंशिक दृष्टिकोणके माध्यम से न्यूरॉन्स के विशिष्ट सेटों में गैर-आक्रामक रूप से व्यक्त किया जा सकता है। लेजर और माइक्रोस्कोप घटकों की कम लागत ने कैल्शियम इमेजिंग 4 के उपयोग में भी वृद्धि कीहै। महत्वपूर्ण रूप से, कैल्शियम इमेजिंग स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में एक साथ एकल न्यूरॉन्स के साथ-साथ बड़ी न्यूरॉन आबादी को रिकॉर्ड करने और अध्ययन करने की अनुमतिदेता है।
फिर भी, कैल्शियम इमेजिंग डेटा का विश्लेषण चुनौतीपूर्ण है क्योंकि (1) इसमें समय के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति में परिवर्तन को ट्रैक करना शामिल है, (2) प्रतिदीप्ति संकेत रुक-रुक कर गायब हो जाता है या न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं के साथ फिर से प्रकट होता है, और (3) न्यूरॉन्स सभी दिशाओं में आगे बढ़ सकते हैं, विशेष रूप से एक फोकल प्लेन के अंदर और बाहर या कई विमानों पर दिखाई दे सकते हैं। 6. मैनुअल विश्लेषण समय लेने वाला है और अव्यावहारिक हो जाता है क्योंकि रिकॉर्डिंग की लंबाई और न्यूरॉन्स की संख्या बढ़ जाती है। कैल्शियम इमेजिंग का विश्लेषण करने की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए विभिन्न सॉफ्टवेयर प्रोग्राम विकसित किए गए हैं। इससे पहले, सॉफ्टवेयर को सीमित प्रयोगात्मक संदर्भ में डिजाइन किया गया था, जिससे अन्य प्रयोगशालाओं के लिए इसे अपनाना मुश्किल हो गया था। सॉफ्टवेयर साझाकरण के लिए आधुनिक मानकों को पूरा करने के हालिया प्रयासों ने कई उपकरणों के विकास को जन्म दिया है जो विभिन्न समूहों में कैल्शियम इमेजिंग डेटा का लगातार विश्लेषण कर सकते हैं 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . हालांकि, इनमें से अधिकांश उपकरणों को प्रोग्रामिंग ज्ञान की आवश्यकता होती है और / या वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर पर निर्भर करते हैं। प्रोग्रामिंग ज्ञान और सॉफ्टवेयर पेवॉल की कमी शोधकर्ताओं को इन तरीकों को अपनाने से रोकती है। इसके अलावा, इनमें से कई उपकरण एक्स / वाई गति को सही करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं, हालांकि जेड-अक्ष पर गति को भी स्पष्ट रूप से निदान और सही करने की आवश्यकता होतीहै। 3 डी कैल्शियम इमेजिंग का विश्लेषण करने के लिए एक कम्प्यूटेशनल टूल की आवश्यकता है जो जेड-ड्रिफ्ट का प्रदर्शन करने वाले न्यूरॉन्स पर केंद्रित है और कई जेड-प्लेन पर दिखाई देता है। आदर्श रूप से, इस उपकरण को ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना चाहिए और अन्य प्रयोगशालाओं को आसानी से अपनाने की अनुमति देने के लिए प्रोग्रामिंग ज्ञान की आवश्यकता नहीं होनी चाहिए।
यहां, हमने 3 डी कैल्शियम इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक नया इमेजजे प्लगइन, टीएसीआई विकसित किया। सबसे पहले, सॉफ्टवेयर का नाम बदलता है, यदि आवश्यक हो, और जेड-पदों द्वारा 3 डी कैल्शियम इमेजिंग डेटा को व्यवस्थित करता है। रुचि की कोशिकाओं को प्रत्येक जेड-स्थिति में ट्रैक किया जाता है, और उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता ट्रैकमेट या अन्य कम्प्यूटेशनल टूल द्वारा निकाली जाती है। टीएसीआई को तब जेड-अक्ष पर गति की जांच करने के लिए लागू किया जाता है। यह जेड-स्टैक के अधिकतम मूल्य की पहचान करता है और इसका उपयोग संबंधित समय बिंदु पर सेल की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने के लिए करता है। यह वर्कफ़्लो सभी दिशाओं में गति के साथ 3 डी कैल्शियम इमेजिंग का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है और / या पार्श्व (एक्स / वाई) दिशा में अतिव्यापी न्यूरॉन्स के साथ लेकिन विभिन्न जेड-स्थितियों में दिखाई देता है। इस वर्कफ़्लो को मान्य करने के लिए, मस्तिष्क में फ्लाई लार्वा थर्मोसेंसिटिव न्यूरॉन्स और मशरूम न्यूरॉन्स से 3 डी कैल्शियम इमेजिंग डेटासेट का उपयोग किया गया था। ध्यान दें, टीएसीआई एक ओपन-सोर्स इमेजजे प्लगइन है और इसे किसी भी प्रोग्रामिंग ज्ञान की आवश्यकता नहीं है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन ने एक नया इमेजजे प्लगइन, टीएसीआई विकसित किया, और 3 डी कैल्शियम इमेजिंग का विश्लेषण करने वाले वर्कफ़्लो का वर्णन किया। वर्तमान में उपलब्ध कई उपकरण एक्स / वाई गति को सही करने पर ध्यान केंद्रित कर?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
फ्रैलिन इमेजिंग सेंटर में एक ज़ीस एलएसएम 880 का उपयोग कैल्शियम इमेजिंग डेटा एकत्र करने के लिए किया गया था। हम आईएमएआरआईएस सॉफ्टवेयर के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ मिशेल एल ओल्सन और युहांग पैन को स्वीकार करते हैं। हम पांडुलिपि पर रचनात्मक टिप्पणियों के लिए डॉ लेनवुड एस हीथ और गिटहब रीडमी फाइल पर टिप्पणियों के लिए स्टीवन गियावसिस को स्वीकार करते हैं। इस काम को एनआईएच आर 21 एमएच 122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) और एनआईएच आर 01 जीएम 140130 (https://www.nigms.nih.gov/) द्वारा एलएन तक समर्थित किया गया था। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
Referências
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis – How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O’Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
