Imagerie subcellulaire de la manipulation neuronale du calcium in vivo
Summary
Les méthodes actuelles décrivent une approche non ratiométrique pour l’imagerie calcique sous-compartimentale à haute résolution in vivo chez Caenorhabditis elegans à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés facilement disponibles.
Abstract
L’imagerie calcique (Ca 2+) a été largement utilisée pour examiner l’activité neuronale, mais il devient de plus en plus clair que la manipulation subcellulaire du Ca2+ est un élément crucial de la signalisation intracellulaire. La visualisation de la dynamique subcellulaire Ca2+ in vivo, où les neurones peuvent être étudiés dans leurs circuits natifs intacts, s’est avérée techniquement difficile dans des systèmes nerveux complexes. La transparence et le système nerveux relativement simple du nématode Caenorhabditis elegans permettent l’expression spécifique de la cellule et la visualisation in vivo de marqueurs fluorescents et d’indicateurs. Parmi ceux-ci figurent des indicateurs fluorescents qui ont été modifiés pour être utilisés dans le cytoplasme ainsi que dans divers compartiments subcellulaires, tels que les mitochondries. Ce protocole permet l’imagerie non ratiométrique Ca 2+ in vivo avec une résolution subcellulaire qui permet l’analyse de la dynamique Ca2+ jusqu’au niveau des épines dendritiques individuelles et des mitochondries. Ici, deux indicateurs génétiquement codés disponibles avec des affinités Ca 2+ différentes sont utilisés pour démontrer l’utilisation de ce protocole pour mesurer les niveaux relatifs de Ca2+ dans le cytoplasme ou la matrice mitochondriale dans une seule paire d’interneurones excitateurs (AVA). Avec les manipulations génétiques et les observations longitudinales possibles chez C. elegans, ce protocole d’imagerie peut être utile pour répondre aux questions sur la façon dont la manipulation du Ca2+ régule la fonction neuronale et la plasticité.
Introduction
Les ions calcium (Ca2+) sont des vecteurs d’information très polyvalents dans de nombreux types de cellules. Dans les neurones, Ca2+ est responsable de la libération dépendante de l’activité des neurotransmetteurs, de la régulation de la motilité cytosquelettique, du réglage fin des processus métaboliques, ainsi que de nombreux autres mécanismes nécessaires au bon entretien et au bon fonctionnementneuronal 1,2. Pour assurer une signalisation intracellulaire efficace, les neurones doivent maintenir de faibles niveaux basaux de Ca2+ dans leur cytoplasme3. Ceci est accompli par des mécanismes coopératifs de manipulation du Ca 2+, y compris l’absorption de Ca2+ dans des organites tels que le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries. Ces processus, en plus de l’arrangement des canaux ioniques perméables Ca 2+ dans la membrane plasmique, entraînent des niveaux hétérogènes de Ca2+ cytoplasmique dans tout le neurone.
L’hétérogénéité Ca 2+ pendant le repos et l’activation neuronale permet la régulation diversifiée et spécifique à l’emplacement des mécanismes dépendants de Ca 2+ 1. Un exemple des effets spécifiques à la concentration de Ca 2+ est la libération de Ca 2+ du RE par les récepteurs de l’inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP 3). De faibles niveaux de Ca2+ en combinaison avec InsP3 sont nécessaires pour l’ouverture du pore perméable au calcium du récepteur. Alternativement, des niveaux élevés de Ca2+ inhibent directement et indirectement le récepteur4. L’importance de l’homéostasie Ca 2+ pour la fonction neuronale appropriée est étayée par des preuves suggérant que la manipulation et la signalisation intracellulaires du Ca2+ perturbées constituent une étape précoce de la pathogenèse des troubles neurodégénératifs et du vieillissement naturel 5,6. Plus précisément, l’absorption et la libération anormales de Ca2+ par le RE et les mitochondries sont liées à l’apparition d’un dysfonctionnement neuronal dans la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington 6,7.
L’étude de la dyshoméostasie Ca 2+ au cours du vieillissement naturel ou de la neurodégénérescence nécessite l’observation longitudinale des niveaux de Ca2+ avec une résolution subcellulaire dans un organisme vivant et intact dans lequel l’architecture cellulaire native (c’est-à-dire la disposition des synapses et la distribution des canaux ioniques) est maintenue. À cette fin, ce protocole fournit des conseils sur l’utilisation de deux capteurs Ca 2+ génétiquement codés facilement disponibles pour enregistrer la dynamique Ca2+ in vivo avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Les résultats représentatifs obtenus à l’aide de la méthode décrite chez C. elegans démontrent comment l’expression des indicateurs Ca 2+ dans le cytoplasme ou la matrice mitochondriale de neurones individuels peut permettre l’acquisition rapide d’images fluorescentes (jusqu’à 50 Hz) qui illustrent la dynamique Ca 2+ avec la capacité supplémentaire de discerner les niveaux de Ca 2+ dans des structures semblables à une seule colonne vertébrale et des mitochondries individuelles.
Protocol
Representative Results
Discussion
La première considération lors de la mise en œuvre de la méthode décrite implique la sélection d’un indicateur Ca2+ avec des caractéristiques idéales pour la question de recherche donnée. Les indicateurs cytoplasmiques Ca 2+ ont généralement une forte affinité pour Ca 2+, et la sensibilité de ces indicateurs au Ca2+ est inversement liée à la cinétique (taux marche/arrêt)16,17. Cela signifie que la sen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 attribué à F. Hoerndli). Nous tenons également à remercier le Dr Attila Stetak pour le plasmide pAS1.
Materials
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
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