Vivo में बरकरार पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया में प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के नेटवर्क में न्यूरोनल एन्सेंबल की कैल्शियम इमेजिंग
Summary
यह प्रोटोकॉल पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) के सर्जिकल एक्सपोजर का वर्णन करता है, जिसके बाद जीसीएएमपी 3 (आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + संकेतक; ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन-कैलमोडुलिन-एम 13 प्रोटीन 3) पिछले पंजे पर विभिन्न प्रकार की उत्तेजनाओं को लागू करते हुए पीर्ट-जीसीएएमपी 3 चूहों का उपयोग करके न्यूरोनल एन्सेंबल की सीए2 + इमेजिंग।
Abstract
सीए2 + इमेजिंग का उपयोग सेलुलर गतिविधि के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया जा सकता है, जिसमें कार्रवाई क्षमता और विभिन्न सिग्नलिंग तंत्र शामिल हैं जिसमें साइटोप्लाज्म में सीए2 + प्रवेश या इंट्रासेल्युलर सीए2 + स्टोर की रिहाई शामिल है। चूहों में पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि (डीआरजी) के प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स की पीआरटी-जीसीएएमपी 3-आधारित सीए2 + इमेजिंग बड़ी संख्या में कोशिकाओं के एक साथ माप का लाभ प्रदान करती है। 1,800 न्यूरॉन्स तक की निगरानी की जा सकती है, जिससे न्यूरोनल नेटवर्क और सोमाटोसेंसरी प्रक्रियाओं को विवो में जनसंख्या स्तर पर उनके सामान्य शारीरिक संदर्भ में एक पहनावा के रूप में अध्ययन किया जा सकता है। निगरानी किए गए न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या गतिविधि पैटर्न का पता लगाने की अनुमति देती है जो अन्य तरीकों का उपयोग करके पता लगाना चुनौतीपूर्ण होगा। उत्तेजनाओं को माउस हिंडपाव पर लागू किया जा सकता है, जिससे डीआरजी न्यूरॉन पहनावा पर उत्तेजनाओं के प्रत्यक्ष प्रभावों का अध्ययन किया जा सकता है। सीए2 + ट्रांसिएंट्स का उत्पादन करने वाले न्यूरॉन्स की संख्या के साथ-साथ सीए2 + ट्रांसिएंट्स का आयाम विशिष्ट संवेदी तौर-तरीकों के प्रति संवेदनशीलता को इंगित करता है। न्यूरॉन्स का व्यास सक्रिय फाइबर प्रकारों (गैर-हानिकारक मेचानो बनाम हानिकारक दर्द फाइबर, ए, ए, और सी फाइबर) के प्रमाण प्रदान करता है। विशिष्ट रिसेप्टर्स को व्यक्त करने वाले न्यूरॉन्स को आनुवंशिक रूप से टीडी-टमाटर और विशिष्ट क्रे रिकॉम्बिनेस के साथ पीर्ट-जीसीएएमपी के साथ लेबल किया जा सकता है। इसलिए, डीआरजी की पीआरटी-जीसीएएमपी 3 सीए2 + इमेजिंग दर्द, खुजली, स्पर्श और अन्य सोमाटोसेंसरी संकेतों का अध्ययन करने के लिए जनसंख्या स्तर पर एक पहनावा के रूप में कार्य करने वाले विशिष्ट संवेदी तौर-तरीकों और न्यूरॉन उपप्रकारों के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण और मॉडल प्रदान करती है।
Introduction
प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स सीधे त्वचा को आंतरिक करते हैं और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र 1,2 में सोमाटोसेंसरी जानकारी वापस ले जाते हैं। पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी) 10,000-15,000 प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स 3,4 के सेल बॉडी क्लस्टर हैं। डीआरजी न्यूरॉन्स विविध आकार, माइलिनेशन स्तर और जीन और रिसेप्टर अभिव्यक्ति पैटर्न पेश करते हैं। छोटे व्यास न्यूरॉन्स में दर्द-संवेदन न्यूरॉन्स शामिल हैं और बड़े व्यास के न्यूरॉन्स आमतौर पर गैर-दर्दनाक यांत्रिक उत्तेजनाओं का जवाब देते हैं 5,6. चोट, पुरानी सूजन और परिधीय न्यूरोपैथियों जैसे प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स में विकार इन न्यूरॉन्स को विभिन्न उत्तेजनाओं के प्रति संवेदनशील बना सकते हैं और पुराने दर्द, एलोडोनिया और दर्द अतिसंवेदनशीलता 7,8 में योगदान कर सकते हैं। इसलिए, डीआरजी न्यूरॉन्स का अध्ययन आम तौर पर सोमाटोसेंसेशन और कई दर्द और खुजली विकारों दोनों को समझने में महत्वपूर्ण है।
विवो में न्यूरॉन्स फायरिंग सोमाटोसेंसेशन के लिए आवश्यक हैं, लेकिन हाल ही में, विवो में बरकरार गैन्ग्लिया का अध्ययन करने के लिए उपकरण अपेक्षाकृत कम संख्या में कोशिकाओंतक सीमित हैं। यहां, हम एक पहनावा के रूप में विवो में जनसंख्या स्तर पर न्यूरॉन्स की कार्रवाई क्षमता या गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली विधि का वर्णन करते हैं। विधि साइटोप्लाज्मिक सीए2 + गतिशीलता के आधार पर इमेजिंग को नियोजित करती है। सीए2 + संवेदनशील फ्लोरोसेंट संकेतक साइटोप्लाज्मिक सीए2 + की सामान्य रूप से कम सांद्रता के कारण सेलुलर गतिविधि को मापने के लिए अच्छे प्रॉक्सी हैं। इन संकेतकों ने चूहों 9,10,11,12,13,14,15,16 और चूहों 17 में सैकड़ों से कई हजारों प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स की एक साथ निगरानी की अनुमति दीहै। इस अध्ययन में वर्णित विवो सीए2 + इमेजिंग की विधि का उपयोग यांत्रिक, ठंडे, थर्मल और रासायनिक उत्तेजनाओं के लिए जनसंख्या स्तर की प्रतिक्रियाओं का सीधे निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।
फॉस्फोइनोसिटाइड-बाइंडिंग मेम्ब्रेन प्रोटीन, पीर्ट को लगभग सभी (>95%) प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स18,19 में उच्च स्तर पर व्यक्त किया जाता है और इसका उपयोग विवो20 में न्यूरॉन गतिविधि की निगरानी के लिए सीए2 + सेंसर, जीसीएएमपी 3 की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, विवो डीआरजी सर्जरी, सीए2 + इमेजिंग, और कॉनफोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (एलएसएम) का उपयोग करके पीआरटी-जीसीएएमपी 3 चूहों 14 के दाईं ओर काठ 5 (एल 5) डीआरजी में प्रदर्शन करने के लिएतकनीकों का वर्णन किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
लगातार दर्द विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में मौजूद है, दुर्बल करता है और / या29 के लगभग 8% लोगों के लिए जीवन की गुणवत्ता को कम करता है। प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स त्वचा पर हानिकारक उत्तेजनाओं का …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान R01DE026677 और R01DE031477 (Y.S.K.), UTHSCSA स्टार्टअप फंड (Y.S.K.), और टेक्सास विश्वविद्यालय प्रणाली (Y.S.K.) से राइजिंग स्टार अवार्ड द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Anased Injection (Xylazine) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
| C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC | Cal Zeiss | 422642-9900-000 | |
| Cotton Tipped Applicators | McKesson | 24-106-1S | |
| Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| DC Temperature Controller Heating Pad | FHC | 40-90-2-05 | |
| Dumont Ceramic Coated Forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| FHC DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fluriso (Isoflurane) | MWI Animal Health, Piramal Group | 501017 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| GelFoam | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Ketaset (Ketamine) | Zoetis | KET-00002R2 | |
| Luminescent Green Stage Tape | JSITON/ Amazon | B803YW8ZWL | |
| Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer | Midmark | 91305430 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Micro dissecting spring scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5677 | |
| Mini Rectal Thermistor Probe | FHC | 40-90-5D-02 | |
| Operating scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice | Johns Hopkins University | N/A | Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice. |
| SMALGO small animal algometer | Bioseb In vivo Research Instruments | BIO-SMALGO | |
| Stereotaxic frame | Kopf Model 923-B | 923-B | |
| td-Tomato C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 7909 | |
| Top Plate, 6 in x 10 in | Newport | 290-TP | |
| TrpV1-Cre C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 17769 | |
| Zeiss LSM 800 confocal microscope | Cal Zeiss | LSM800 | |
| Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software | Cal Zeiss | Zen (Blue Edition) 2.6 |
Referências
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