心停止・蘇生・自然循環復帰後の心損傷と血行動態を研究するための子豚周産期仮死モデル

プロトコルはノルウェー食品安全局(承認番号25030)によって承認され、実験はヨーロッパ、ノルウェー、および機関の規制に従って実施されました。このモデルの複製には、制度的および国内の規制に沿った動物実験の倫理的承認を取得し、3つのRs23に従って実験を確実に実施する必要があります。動物を取り扱うすべての人員は、EU指令2010/63/EU 24の第23条および第24条、または同等のものに従って、機能A、B、およびDの認証を受ける必要があります。実験全体を通して動物を注意深く監視し、麻酔、人工呼吸器の設定、温度、および動物の位置を調整して、動物の健康を確保します。モデルとそのアプリケーションを定期的に批判的に評価し、必要に応じて可能な限り調整します。 注:この研究で使用された子豚は、生後12〜36時間、体重1.7〜2.3 kg、性別分布が等しく、ノルウェーのランドレース、デュロック、ヨークシャーの混合人種であり、遺伝的に改変されていませんでした。プロトコルのステップ1とステップ2には、実験全体に適用される全身麻酔とデータサンプリング手順が含まれ、ステップ3〜10は、動物の準備、外科的介入、心停止までの窒息、蘇生、および蘇生後の観察を含む実験手順を詳述します。 1.麻酔プロトコル(TIME:実験全体に適用されます) IVフェンタニル(50 μg / kg)とペントバルビタール(15-20 mg / kg)のボーラスで麻酔を誘発します 耳静脈の末梢静脈カテーテルで。注意: フェンタニルは吸入または摂取すると有害であり、目や皮膚を刺激します。また、制限薬物です。その供給と使用は、制限された薬物の規制に従って監視および規制されるべきです。.ペントバルビタールは摂取すると有害であり、目や皮膚を刺激します。 窒息するまでIVフェンタニル(50 μg / kg / h)で麻酔を維持し、窒息中に停止し、自然循環(ROSC)の復帰後に25 μg / kg / hで再開します。.注:このモデルで使用されている高用量フェンタニル麻酔は、新生児科医と小児麻酔科医が関与する共同作業でモデルを改良してきた数十年に由来しています。高用量フェンタニル麻酔は、ヒトの成人および新生児における心血管および血行動態の安定性25,26と関連している。しかし、新生子豚を対象としたある研究では、フェンタニルの使用がHRと心拍出量(CO)の低下、平均動脈圧(MAP)、左室拡張末期圧、および総末梢抵抗指数の増加に関連していることが示されました27。 実験全体を通して子豚の健康状態を監視します。筋肉の緊張をチェックし、バイタルを評価して、子豚が完全に麻酔されていることを確認します。子豚が苦痛の兆候を示している場合は、臨床判断に従って追加のIVフェンタニルまたはIVペントバルビタールを投与します。. 2.データのサンプリングと登録(TIME:実験全体に適用されます) 子豚ごとに紙のケース登録フォーム(CRF)を印刷します。CRFには、HR、BP(MAPを含む)、酸素飽和度(SpO2)、局所脳酸素飽和度(NIRS)、体温、提供される追加の薬、および震えに関する情報が含まれています。 CRFで、子豚にID番号を付け、子豚の体重と性別をフロントページに記録します。 安定化期間中および窒息誘発直前に5分ごとに登録を行う。窒息誘発後、10分後に最初の登録を行い、その後心停止するまで5分ごとに登録します。ROSCが達成された場合は、ROSC後できるだけ早く、ROSC後の最初の1時間は5分ごとに、残りの観察期間は30分ごとに登録してください。 CRFで、異なる標本をいつ収集するかを述べます。安定化の開始時、窒息の誘発直前、心停止時、ROSCで、ROSC後30分、60分、120分、240分、および540分、および研究の終了時(570分)に全血と血漿を収集します。注:各子豚からどれだけの量の血液を採取できるかを計算することが重要です。一例として、より小さな子豚、不安定な子豚、および首の手術でいくらかの失血に苦しんでいる子豚から採取できる血液は少なくなります。また、実験全体を通して酸塩基状態からヘモグロビン(Hb)を観察することも重要です。この研究では、Hb <6 g / dLの子豚は除外されました。 ROSC後240分および研究終了時(570分)に尿を収集します。 安定化の開始時、仮死誘発直前、仮死誘発後10分、および心停止まで5分ごとに酸塩基状態をとる。心停止時、ROSC時、ROSC後5分、15分、30分、60分、120分、240分、および540分、および研究終了時(570分)に酸塩基状態を取得します。 研究の終了時(570分)に脳脊髄液(CSF)を収集します。 中心動脈カテーテルから全血と血漿を収集します。中心動脈カテーテルからヘパリン処理シリンジに2 mLの血液を抜き取り、横に置きます。 次に、2.5 mLの血液を新しいヘパリン化シリンジに抜き取ります。.最後に採取した全血0.5 mLを微量遠心チューブに入れ、液体窒素で急速凍結します。 残りの2 mLを適切なサイズのEDTAバイアルに入れ、1,700 x g で4°Cで10分間遠心分離します。血漿(バフィーコートと赤血球から最上層として分離する)をマイクロ遠心チューブにピペットで入れ、液体窒素で急速凍結します。 中心動脈カテーテルからさらに0.2mLの血液を新しいヘパリン化シリンジに抜きます。シリンジを酸ベースマシンに入れ( 材料表を参照)、関連情報(ID、時点、子豚の温度)を入力します。 最初のヘパリン化シリンジに抜かれた血液を動脈カテーテルに押し戻します。動脈カテーテルをヘパリン化生理食塩水で洗い流して、すべての血液が子豚の循環に戻されるようにします。 尿の恥骨上吸引によって尿を集める。ランドマークを見つけます:乳首の3番目に低いペアと2番目に低いペアの間の領域、臍の下約2 cm、正中線の外側数ミリメートル。 23 Gのカニューレを備えた10 mLのシリンジを使用します。カニューレを垂直に約1 cm進め、注射器が尿で満たされるまで吸引します。尿を極低温チューブに入れ、液体窒素で急速凍結します。 腰椎穿刺によってCSFを収集します。子豚を横に置き、後肢を胸に向かって引き上げます。ランドマークを見つけます:子豚の腸骨稜のレベルで脊椎タグの間。 CSFが現れるまで、21Gのカニューレを脊椎タグの間でわずかに頭蓋方向に進めます。CSFを微量遠心チューブに入れ、液体窒素中で急速凍結します。 データ収集および分析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、継続的なECGおよび侵襲性動脈血圧データを収集します(ステップ6およびステップ7を参照)。市販のNIRSマシン( 材料表を参照)を使用してNIRS(手順7を参照)を実行します。 3.準備(時間:必要な限り、数週間から数か月) 動物実験の倫理的承認を得る。 農家に連絡し、子豚の選択(年齢:12〜36時間、男女均等分布、体重:1.7〜2.3 kg)、出産日、および輸送の手配を整理します。注:同じ種族(この研究では、ノルウェーのランドレース、デュロック、ヨークシャーのミックス)と農場から、理想的には同じ同腹仔から狭い年齢範囲内の子豚を選択することは、生物学的および生理学的差異を減らすために重要です。 設定された日付に担当者が対応可能であることを確認してください。 必要な機器がすべて利用可能であり、すべての機器と観測ツールが機能していることを確認してください。窒息ガス(8%O 2、92%N2)の有効期限と、空でないことを確認してください。 子豚を受け入れる準備ができているようにラボとすべての機器をセットアップします。必要なすべての機器を調整します。 ランダム化比較試験の場合はサンプルサイズの推定を行い、子豚のランダム化を準備します。 4.子豚の受け入れ(時間:子豚の数に応じて10分から2時間) 実験当日に農場から外科施設への家畜の子豚の輸送を組織する。子豚の温度を維持するために、容器の「床」を細かい木材チップと湯たんぽで覆います。空気の循環を確保するために、容器にバリ穴を開けます。 子豚の年齢と体重に関する情報を農家から入手します。到着時に体重を確認してください。 子豚が容器の中で落ち着いて安心している間に、子豚の後肢にパルスオキシメータ(PO)プローブ(材料表を参照)を置いてSpO2とHRを測定します。 すべての器具を準備し、手術台の電気加熱マットレスの熱をオンにします。 チームの全員が麻酔と外科的介入の準備ができるまで、子豚を容器の中で休ませます。 5.麻酔、挿管、および機械的換気の導入(時間:15分) IVアクセスと挿管のために機器を準備します。 麻酔および挿管の誘導中の酸素化およびHRのモニタリングのために、POプローブを後肢に適用します。 人がくるんだ子豚をじっと落ち着かせていることを確認してください。2人が末梢静脈内カテーテルを耳静脈に挿入していることを確認します。カテーテルを約1mLの生理食塩水で洗い流して、配置を確認します。カテーテルをテープで固定します。 ボーラス用量のフェンタニルとペントバルビタールを耳の静脈に注射します(手順1.1で説明)。カテーテルを1mLの生理食塩水で洗い流します。離脱反射を評価して子豚が麻酔をかけられていることを確認してください。 その人が子豚を仰臥位に置くことを確認してください。口を開き、10 cm x 10 cmのガーゼ綿棒で舌を引き出します。喉頭を一直線に保ちます。 2人が喉頭鏡( 材料表を参照)を使用して舌を持ち上げることを確認します。喉頭鏡を進めて喉頭蓋を持ち上げ、声帯を視覚化します。気管内チューブ(ETT、 材料表を参照)を声帯を通して進めます。注:カフ付きETTを使用すると、声帯を介したETTの前進がより困難になる可能性があります。挿管が困難な場合は、子豚のバイタルサインを観察することが特に重要です。バイタルが落ちた場合は、子豚の鼻の上にマスクを置き、マスクを自己膨張バッグに接続し、バイタルが正常になるまで子豚を手動で換気します。その後、もう一度挿管してみてください。それでも難しい場合は、ペントバルビタールを追加投与することを検討してください。まれなケース(例:.、上気道異常)、気管切開を行う必要があります。しかし、経験豊富なスタッフであれば、挿管は通常簡単に行うことができます。 ETTを自己膨張バッグ( 材料表を参照)に接続し、手動換気を開始します。 1)換気時の両側対称の胸部上昇、2)上腹部からの空気侵入音のない肺野上の両側および対称呼吸音、3)SpO2 およびHR応答、および4)ETT内の結露によって正しいETT配置を確認します。期限切れのCO2 は、疑わしい場合は(半)定量的に測定することもできます。 ETTカフを膨らませます。ETTを縦方向に半分に分割したテープで12〜13 cmの深さ(2 kgの子豚の場合)に固定します。前歯のすぐ遠位にあるETTの部分の周りにテープをドレープし、鼻の周りを続けます。 子豚が外科的介入テーブルに移され、そこで人工呼吸器に接続されるまで、子豚を手動で換気し続けます。テーブル上で、ETTを次の設定で機械式人工呼吸器(材料表を参照)に接続します:P Insp = 15-20 cm H 2 O、のぞき見= 5.0 cm H2O、流量Insp = 8.0 L / min、周波数= 30 bpm、およびT Insp = 0.34秒。 注:子豚にSpO 2 <90%がある場合、SpO2が≥90%になるまでPInspと周波数を増やすことができます。蘇生プロトコルが異なるFiO2sの比較を含まない場合、酸素補給を使用できます。 直腸体温計を置き、子豚の尾の周りにサージカルテープで固定します。 子豚の下の加熱マットレスの温度を調整するか、ゴム/ラテックス手袋に熱い水道水を入れて子豚を囲むタオルに入れることにより、子豚の温度(38.5〜39.0°C)を巣のように子豚の周りに掛けて維持します。外科的介入中の子豚の温度を観察し、必要に応じて体温安定化対策を講じてください。 6.外科的介入(時間:20分) 必要な機器をすべて準備し、すべてのカテーテルに通常の生理食塩水を満たします(図1)。CRFで外科的介入が開始される時間を書き留めます。 麻酔をかけた子豚の皮膚を、3〜5個の外科用スポンジを使用して5 mg / mLの着色クロルヘキシジンで滅菌します。 メスを使用して子豚の首の右側に長さ2.5 cmの皮膚切開を行います。 まぶたの開創器を使用して、切開部の両側の皮膚を引っ込めます。 動脈鉗子を使用して、内頸静脈を解剖して露出させます(図2)。 頸静脈の下に2本のナイロン3-0縫合糸を置き、安定させます。 片方の縫合糸を持ち、もう一方の手で中心静脈カテーテルを持ちます(図3)。中心静脈カテーテルを挿入し、針を引き抜きます。 カテーテルが静脈の内側にある領域で、静脈(およびカテーテル)の周りに静脈を保持するために使用された縫合糸の1つを結びます(図4)。注意: 保持縫合糸がカテーテルの周りにきつく結びすぎていないこと、および結び目がカテーテルの遠位先端に近位にあることを確認してください。 1 mLの生理食塩水で洗い流して、カテーテルの正しい配置を確認します。 吸収性4-0縫合糸で皮膚を閉じます。 フェンタニル50 μg / kg / hとバランスの取れた炭水化物電解質溶液(10 mg / mLグルコース、 材料表を参照)を中心静脈カテーテルに接続します。 メスを使用して子豚の首の左側に長さ2.5 cmの皮膚切開を行います。切開部を首の右側の切開部よりもわずかに内側にします。 まぶたの開創器を使用して、切開部の両側の皮膚を引っ込めます。 次に、動脈鉗子を使用して総頸動脈(胸鎖乳突筋の内側)を解剖して露出させます。 2本のナイロン3-0縫合糸を総頸動脈の下に置き、安定させます。 片方の手で縫合糸の1つを持ち、もう一方の手で中心動脈カテーテルを持ちます。中心動脈カテーテルを挿入し、針を引き抜きます。 カテーテルが動脈の内側にある領域で、動脈(およびカテーテル)の周りに動脈を保持するために使用された縫合糸の1つを結びます。注意: 保持縫合糸がカテーテルの周りにきつく結びすぎていないこと、および結び目がカテーテルの遠位先端に近位にあることを確認してください。 1 mLの生理食塩水で洗い流して、カテーテルの正しい配置を確認します。 吸収性のある4-0縫合糸を使用して、カテーテルウィングを皮膚に固定し、皮膚を閉じます。 侵襲的動脈BPモニタリング( 材料表を参照)に接続し、データ収集および分析ソフトウェアを使用して記録を開始します。注意: 正しい血圧測定値を得るために、侵襲的動脈BPトランスデューサーが心臓レベルで校正されていることを確認してください。 透明な包帯で覆います。現在、中心動脈カテーテルが設置されています。 手術が終了した時刻をCRFに書き留めます。 7.安定化(時間:最低1時間ですが、手術後の子豚を安定させ、スタッフが窒息の誘発に備えるために必要な限り) 子豚をECG監視装置に接続します( 材料表を参照)。電極を配置する前に、必要に応じて髪を剃って取り除きます。胸郭の両側、つまり各上肢の内側に2つの電極を配置します。3番目の電極を臍の左側に置きます。 リード線を電極に接続し、データ収集および解析ソフトウェアを使用して記録を開始します。 子豚を非侵襲的COモニタリング装置に接続します( 材料表を参照)。電極を配置する前に、必要に応じて髪を剃って取り除きます( 材料表を参照)。最初の電極を子豚の頭の上、目のすぐ後ろに、2番目の電極を首の左側に、3番目の電極を腹部の左側に、中央腋窩を臍の高さに、4番目の電極を左大腿部に置きます。 デバイスに関連情報を入力し、録音を開始します。内部メモリが限られているため、実験時間に応じてサンプリングレートを調整してください。 子豚をNIRSモニタリングに接続します。電極を配置する前に、必要に応じて髪を剃って取り除きます。NIRS電極( 材料表を参照)を子豚の頭のてっぺん、非侵襲性CO電極の後ろに置き、光から保護するために不透明なテープで固定します。 該当する場合は子豚を追加のモニタリング機器に接続し、これが実験プロトコルの一部である場合は心エコー検査を実行します。 子豚を快適な位置、できればうつ伏せに置きます。 安定化期間中に測定と登録を行い、CRFに記録します(ステップ2を参照)。 安定化期間中の温度、SpO2、HR、BP、および震えに関して子豚を観察します。人工呼吸器の設定と子豚の温度を調整し、必要に応じて追加の麻酔を与えます。 8.窒息および心停止の誘発(時間:15〜60分、子豚によって異なります) 注:関係するすべての人員は、窒息を誘発する前に自分の役割を知る必要があります。 窒息を開始する時間を決定し(安定化の期間と人員の利用可能性に基づいて)、これをCRFに書き留めます。 子豚の生理学的測定値をCRFに書き留め、窒息が誘発される直前に血液サンプルを採取します。 仮死が始まる直前にフェンタニルIVを停止します。 仮死を開始するには、機械式人工呼吸器の酸素ダイヤルを100%に回し、人工呼吸器の酸素ホースを窒息ガス(8%O 2、92%N2)に切り替えます。 人工呼吸器のレートを10インフレ/分削減します。 子豚のSpO2 が落下し、誘導が成功したことを確認します。 10分間の窒息の後、人工呼吸器の率をさらに10インフレ/分下げます。 10分間の窒息の後、その後5分ごとに、酸塩基の状態を取り、子豚の生理学的測定値をCRFに書き留めます。心停止まで続けます。 20分の窒息の後、人工呼吸器の率をさらに10インフレ/分下げます。 30分間の窒息の後、動脈鉗子でETTをクランプします。 MAPが20 mm Hgを下回ったら、心臓の連続聴診を開始します。注:心停止は、聴診および/または動脈線脈動の喪失による聞こえない心拍として定義されます。ECGで無パルス電気活動(PEA)が発生する可能性があることに注意してください。 その人が心臓を聴診することを確認してください。ETTクランプを取り外している間、心拍が聞こえなくなったとき(心停止)に大声で呼びかけます。2人が人工呼吸器の仮死ガスホースを酸素出口に戻します。CRFに心停止の時刻を記録し、タイマーを開始します。 プロトコルによって割り当てられたFiO 2を設定します(この研究では、子豚を0.21または1.0のFiO2を受け取るように無作為化しました)。ベンチレーターの設定を次のように設定します:PInsp = 30 cm H 2 O、のぞき見= 5.0 cmH2O、流量入力= 8.0 L / min、周波数= 40 bpm、およびTinsp = 0.34秒。 ステップ2.5で説明したように、心停止時点から血液サンプルを採取します。 9.心肺蘇生法(CPR)(時間:0〜15分) 注:CPRは、蘇生に関する国際連絡委員会(ILCOR)ガイドライン28に従って実施でき、 研究の目的に応じて、胸部圧迫と換気の比率が3:1、または胸骨圧迫と換気の比率が異なります。 ILCORが推奨する3:1 CPRを使用する場合は、次の手順を実行します。心停止後30秒間子豚を機械的に換気する。次に、胸骨圧迫を開始し、胸骨圧迫と換気の比率を3:1にすることを目指します。注意: 人工呼吸器は人ではなく換気を行うため、胸骨圧迫と換気は同時/調整されていない場合があります。 胸部を胸部前後直径の1/3の深さまで圧迫し、胸部の完全な反動を可能にし、2本の親指で囲む手のテクニックを使用します。収縮期動脈圧≥20 mm Hgを生成することを目指します。 アドレナリン(0.02-0.03 mg / kg)IVを30秒の胸骨圧迫後、その後3分間のCPRごとに投与します(最大4回の投与)。各アドレナリン投与後に1mLの生理食塩水で洗い流してください。. 動脈BPトレースとECGを観察してROSCを決定し、心臓聴診で確認します。ROSCの定義は、安定した、補助なしのHR≥100bpmです。 ROSCまで、または最大15分間、蘇生努力を続けます。CPRが15分以内に成功しない場合は、蘇生努力を中止し、死亡時刻を記載し、CRFに記録します。 蘇生努力が成功した場合は、ROSCの時間、秒単位のCPRの持続時間、および投与されたアドレナリン投与の数をCRFに書き留めます。 ROSCの直後に血液サンプルとCRF登録を採取し、ステップ2の説明に従って登録をさらに9.5時間(570分)続行します。 10. ROSC後の観測(時間:9.5時間) フェンタニルIV注入を最初に25 μg / kg / hで再開し、臨床効果/要件に従って滴定します。.注:窒息中および窒息後に、代謝率が低下するため、フェンタニルIVの用量が低くなります。ただし、一部の子豚はより高い注入速度を必要とする可能性があるため、子豚のバイタルと反射を観察することが重要です。 子豚を9.5時間注意深く監視します。SpO 2 ≥90%を維持し、正常炭酸ガスプニア(5〜7.5 kPaのCO 2(pCO2)の温度調整分圧)を維持するために、必要に応じて機械式人工呼吸器の設定を調整します。 子豚の温度を38.5〜39.0°Cに維持し、示されているように温度補正対策を講じます。注:子豚は窒息中および窒息後に低体温になる傾向があります。 CRFによって指示された所定の時点でサンプルとCRF登録を取得します(ステップ2)。 ROSC後の観察の9.5時間で、子豚を安楽死させます(ステップ11)。注:一部の子豚は、ROSC後の観察の9.5時間全体を生き残れない可能性があります。子豚が重大な苦痛と悪化の兆候を示している場合は、早めに安楽死を行ってください。 11.安楽死(時間:10分) 必要な手術器具、組織サンプルを保存するためのバイアル、およびサンプルを急速凍結するための液体窒素を備えた解剖台を準備します。 ステップ2の説明に従って、研究終了(570分)のサンプルを収集します。 IVペントバルビタール150 mg / kgを投与します。.解剖を行い、臓器サンプルをマークされた極低温チューブに入れ、液体窒素で急速凍結します。必要に応じて、脳の半分をホルマリンで保存します。 実験からのサンプル(全血、血漿、尿、CSF、および臓器サンプル)を-80°Cの冷凍庫に入れるか、計画された分析で指定された別の方法で保管します。 図1:手術器具を備えた滅菌テーブル。 手術器具は、頸部手術の開始前に準備され、滅菌テーブルに保管されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:内頸静脈。 それが自由に解剖されそして露出された後の内頸静脈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:中心静脈カテーテルの挿入。 縫合糸は、中心静脈カテーテルの挿入直前に保持されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:中心静脈カテーテルを固定するための縫合糸。 縫合糸は静脈(およびカテーテル)の周りに結ばれ、カテーテルを静脈内に固定します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。