변형된 효소 결합 면역흡착 분석을 사용한 인간 혈장 내 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)의 검출 및 정량화
Summary
인간 혈장 내 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 농도와 관련된 발표된 데이터는 일관성이 없습니다. 이러한 불일치는 이 신경펩티드를 정량화하기 위한 표준화되고 검증된 방법론이 없기 때문일 수 있습니다. 여기에서는 인간 혈장에서 CGRP를 정제하고 정량화하기 위한 검증된 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)는 편두통의 병태생리학에서 추정되는 역할을 하는 혈관활성 신경펩타이드이며 바이오마커 상태의 후보가 될 수 있습니다. CGRP는 활성화시 신경 섬유에서 방출되어 삼차 원심성 신경 분포를받는 혈관 구조에서 멸균 신경 인성 염증 및 동맥 혈관 확장을 유도합니다. 말초 맥관 구조에서 CGRP의 존재는 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)과 같은 단백질체 분석을 사용하여 인간 혈장에서이 신경 펩티드를 검출하고 정량화하기위한 연구에 박차를 가했다. 그러나 6.9분의 반감기와 종종 완전히 설명되지 않은 분석 프로토콜의 기술적 세부 사항의 가변성으로 인해 문헌에서 일관되지 않은 CGRP ELISA 데이터가 생성되었습니다. 여기서, 인간 혈장에서 CGRP의 정제 및 정량화를위한 수정 된 ELISA 프로토콜이 제시된다. 절차적 단계에는 시료 수집 및 준비, 정제 수단으로 극성 흡착제를 사용한 추출, 비특이적 결합을 차단하기 위한 추가 단계, ELISA를 통한 정량화가 포함됩니다. 또한, 이 프로토콜은 희석 실험의 스파이크 및 회수 및 선형성으로 검증되었습니다. 이 검증 된 프로토콜은 이론적으로 편두통뿐만 아니라 CGRP가 역할을 할 수있는 다른 질병이있는 개인의 혈장에서 CGRP 농도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)는 혈관주위 국소화가 있는 뉴런 섬유와 비뉴런 조직에 존재하는 37개 아미노산 뉴로펩타이드입니다. CGRP의 두 가지 형태 인 α-CGRP와 β-CGRP는 90 % 이상의 상 동성을 공유하고 생리 기능을 공유합니다. 그러나 αCGRP는 중추 신경계 및 말초 신경계에서 발견되는 반면 βCGRP는 장 신경계에서 발견됩니다 1,2. 통각 수용체 활성화 및 칼슘 의존성 엑소 사이토 시스시, CGRP는 뉴런에서 방출되어 동맥 혈관 확장 및 혈장 단백질 유출을 포함하는 무균 신경 인성 염증을 유도합니다 3,4,5,6,7. 여기에서 CGRP는 모세 혈관 후 혈관에 나타나며 편두통 8,9,10,11과 같은 구 심성 통각 수용 활성화를 유발하는 질병에 대한 바이오 마커 일 수 있습니다. 참고로, CGRP는 혈관 신생 및 면역 조절에서의 역할을 통해 COVID-19와 관련이 있으며 바람직하지 않은 질병 진화를 예측할 수 있습니다12,13. 따라서, 인간 혈장에서 CGRP의 정확한 정량화를위한 프로토콜은 광범위한 가치를 가질 수있다.
편두통에서 CGRP의 역할에 가장 많은 관심을 기울였을 것입니다. 전임상 및 임상 연구를 기반으로 CGRP는 편두통에 대한 가능한 바이오 마커 및 치료 표적으로 제시되었습니다 3,4,5,6,7,8,9,10. 일부 연구에서는 대조군 참가자10,14,15에 비해 일시적인 편두통이 있는 코호트에서 CGRP의 상승을 발견했습니다. 편두통 치료를위한 임상 시험에서 CGRP 억제제의 성공은 편두통의 원인 인자로서 CGRP 상승을 암시하는 것으로 보인다. 그러나 모든 조사자가 이러한 결과를 확증한 것은 아닙니다(16,17,18,19). 또한, 편두통의 비 두통 증상에서 CGRP의 역할은 아직 밝혀지지 않았다. 현재의 연구는 편두통의 전정 증상에서 CGRP의 역할을 이해하고자하는 열망에 의해 동기가 부여되었습니다.
문헌에서 일관되지 않은 CGRP 면역 분석 데이터는 몇 가지 이유 때문일 수 있습니다. 첫째, 말초 맥관 구조에서 CGRP의 반감기는 세린 프로테아제 21, 인슐린 분해 효소 및 기타 메탈로 프로테아제 22, 중성 엔도 펩티다아제 23 및 엔도 텔린 전환 효소 -1 24의 활성으로 인해 6.9 분 20이다. 둘째, CGRP를 정량화하는 데 사용되는 면역 측정법의 다양한 기술적 세부 사항은 그러한 연구에서 완전히 설명되지 않았습니다. 마지막으로, 면역 분석 방법론의 표준화 부족은 그림을 더욱 복잡하게 만듭니다.
이 기사에서는 인간 혈장에서 α- 및 βCGRP의 정제 및 정확한 정량화를 허용하는 수정된 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 프로토콜에 대해 설명합니다. 키트의 항체는 아밀린, 칼시토닌 또는 물질 P와 교차 반응하지 않습니다. 이 프로토콜은 스파이크 및 회수 및 희석의 선형성과 같은 필요한 검증 실험을 거쳤으며, 이에 대한 데이터는 여기에 제시되어 있습니다. 검증을 거친 이러한 CGRP ELISA 프로토콜은 이전에 문헌에 완전히 설명되지 않았습니다. 이 프로토콜은 편두통뿐만 아니라심장 2,25, 피부과 26, 산부인과 27, 류마티스28,29, 근골격계30,31, 내분비 32,33 및 바이러스 성 질환12,13의 맥락에서 인간 혈장에서 CGRP를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서는 인간 혈장에서 CGRP의 검출 및 정량화를 허용하는 검증된 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상용 CGRP ELISA 키트가이 분자를 정확하게 정량화하지 못하는 것으로 밝혀진 후에 합성되었습니다. 샘플 준비 프로토콜과 유효한 표준 곡선을 확립한 후, 희석 실험의 스파이크 및 회수율 및 선형성은 회수율이 예상보다 훨씬 낮다는 것을 보여주었다. 상이한 상용 CGRP ELISA 키트를 사…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로토콜에 대한 유용한 토론을 해주신 Robert N. Cole, Lauren R. DeVine, Marcos Iglesias에게 감사드립니다. 이는 미국 이비인후과 학회(Fellowship Grant, PSK), 미국 청력 연구 재단(90066548/90072266, JPC), 국립 보건원(NIH)의 구성 요소인 국립 중개 과학 발전 센터(NCATS) 및 NIH 의학 연구 로드맵(UL1 TR003098, NSF)의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다. 출판물의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 Johns Hopkins ICTR, NCATS 또는 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus – Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
Referências
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
- Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
- Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
- Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
- Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
- Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
- Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
- Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
- Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
- Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
- Kraenzlin, M. E., Ch’ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
- Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
- Kim, Y. -. G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
- Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
- Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
- Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
- Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
- Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
- Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
- Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
- Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
- Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat’s knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neurociência. 71 (4), 1095-1109 (1996).
- Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
- Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H. Calcitonin gene-related peptide in human obesity. Peptides. 12 (4), 861-863 (1991).
- World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , (2010).
- Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
- Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
- Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
- Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
- Lee, J. -. E., Kim, S. Y., Shin, S. -. Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
- Fan, P. -. C., Kuo, P. -. H., Lee, M. T., Chang, S. -. H., Chiou, L. -. C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
- Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).
