एक संशोधित एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख का उपयोग करके मानव प्लाज्मा में कैल्सीटोनिन जीन-संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) का पता लगाना और परिमाणीकरण
Summary
मानव प्लाज्मा में कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) सांद्रता से संबंधित प्रकाशित डेटा असंगत हैं। ये विसंगतियां इस न्यूरोपैप्टाइड को निर्धारित करने के लिए एक मानकीकृत, मान्य पद्धति की कमी के कारण हो सकती हैं। यहां, हम मानव प्लाज्मा में सीजीआरपी को शुद्ध करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मान्य एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) एक वासोएक्टिव न्यूरोपैप्टाइड है जो माइग्रेन सिरदर्द के पैथोफिज़ियोलॉजी में एक कथित भूमिका निभाता है और बायोमार्कर स्थिति के लिए एक उम्मीदवार हो सकता है। सीजीआरपी सक्रियण पर न्यूरोनल फाइबर से जारी किया जाता है और वाहिका में बाँझ न्यूरोजेनिक सूजन और धमनी वासोडिलेशन को प्रेरित करता है जो ट्राइजेमिनल अपवाही संक्रमण प्राप्त करता है। परिधीय वाहिका में सीजीआरपी की उपस्थिति ने प्रोटिओमिक परख का उपयोग करके मानव प्लाज्मा में इस न्यूरोपैप्टाइड का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए जांच को प्रेरित किया है, जैसे कि एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा)। हालांकि, 6.9 मिनट के इसके आधे जीवन और परख प्रोटोकॉल के तकनीकी विवरणों में परिवर्तनशीलता, जो अक्सर पूरी तरह से वर्णित नहीं होती है, ने साहित्य में असंगत सीजीआरपी एलिसा डेटा प्राप्त किया है। यहां, मानव प्लाज्मा में सीजीआरपी के शुद्धिकरण और परिमाणीकरण के लिए एक संशोधित एलिसा प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्रक्रियात्मक चरणों में नमूना संग्रह और तैयारी, शुद्धिकरण के साधन के रूप में ध्रुवीय शर्बत का उपयोग करके निष्कर्षण, गैर-विशिष्ट बंधन को अवरुद्ध करने के लिए अतिरिक्त कदम और एलिसा के माध्यम से मात्रा का ठहराव शामिल है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को स्पाइक और रिकवरी और कमजोर पड़ने वाले प्रयोगों की रैखिकता के साथ मान्य किया गया है। इस मान्य प्रोटोकॉल का उपयोग सैद्धांतिक रूप से न केवल माइग्रेन वाले व्यक्तियों के प्लाज्मा में सीजीआरपी सांद्रता को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि अन्य बीमारियों के साथ भी किया जा सकता है जिसमें सीजीआरपी एक भूमिका निभा सकता है।
Introduction
कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) एक 37-एमिनो एसिड न्यूरोपेप्टाइड है जो पेरिवास्कुलर स्थानीयकरण के साथ-साथ गैर-न्यूरोनल ऊतकों के साथ न्यूरोनल फाइबर में मौजूद है। सीजीआरपी के दो रूप, α- और β-सीजीआरपी, 90% से अधिक होमोलॉजी साझा करते हैं और शारीरिक कार्यों को साझा करते हैं; हालांकि, केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र में एसीजीआरपी पाया जाता है, जबकि आंत्र तंत्रिका तंत्र 1,2 में पाया जाता है। नोसिसेप्टर सक्रियण और कैल्शियम-निर्भर एक्सोसाइटोसिस पर, सीजीआरपी न्यूरॉन्स से जारी किया जाता है, जो धमनी वाहिकाफैलाव और प्लाज्मा प्रोटीन एक्स्ट्रावेसन 3,4,5,6,7 से जुड़े बाँझ न्यूरोजेनिक सूजन को प्रेरित करता है। यहां से, सीजीआरपी पोस्टकेशिका वाहिकाओं में दिखाई देता है और उन बीमारियों के लिए बायोमार्कर हो सकता है जो अभिवाही नोसिसेप्टिव सक्रियण का कारण बनते हैं, जैसे माइग्रेन 8,9,10,11। ध्यान दें, सीजीआरपी को एंजियोजेनेसिस और प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन में अपनी भूमिका के माध्यम से सीओवीआईडी -19 में भी फंसाया गया है, और प्रतिकूल रोग विकास की भविष्यवाणी कर सकता है12,13. इस प्रकार, मानव प्लाज्मा में सीजीआरपी की सटीक मात्रा के लिए एक प्रोटोकॉल का व्यापक मूल्य हो सकता है।
माइग्रेन में सीजीआरपी की भूमिका पर शायद सबसे अधिक ध्यान दिया गया है। प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अध्ययनों के आधार पर, सीजीआरपी को माइग्रेन के लिए एक संभावित बायोमार्कर के रूप में और उपचार 3,4,5,6,7,8,9,10 के लिए एक लक्ष्य के रूप में सामने रखा गया है। कुछ अध्ययनों में10,14,15 को नियंत्रित करने के सापेक्ष एपिसोडिक माइग्रेन वाले समूहों में सीजीआरपी की वृद्धि पाई गई है। माइग्रेन सिरदर्द उपचार के लिए नैदानिक परीक्षणों में सीजीआरपी अवरोधकों की सफलता माइग्रेन सिरदर्द के लिए एक कारण कारक के रूप में ऊंचा सीजीआरपी को फंसाती है। हालांकि, सभी जांचकर्ताओं ने इन परिणामों की पुष्टि नहीं कीहै 16,17,18,19। इसके अलावा, माइग्रेन के गैर-सिरदर्द लक्षणों में सीजीआरपी की भूमिका अभी तक स्पष्ट नहीं हुई है; वर्तमान काम माइग्रेन के वेस्टिबुलर लक्षणों में सीजीआरपी की भूमिका को समझने की इच्छा से प्रेरित था।
साहित्य में असंगत सीजीआरपी इम्यूनोसे डेटा कई कारणों से हो सकता है। सबसे पहले, परिधीय वाहिका में सीजीआरपी का आधा जीवन 6.9 मिनट 20 है, जो सेरीन प्रोटीज 21, इंसुलिन-डिग्रेडिंग एंजाइम और अन्य मेटालोप्रोटीज 22, तटस्थ एंडोपेप्टिडेस 23, और एंडोथेलिन-परिवर्तित एंजाइम -1 24 की गतिविधि के कारण है। दूसरे, सीजीआरपी को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले इम्यूनोएसे के चर तकनीकी विवरण ऐसे अध्ययनों में पूरी तरह से वर्णित नहीं हैं। अंत में, इम्यूनोएसे पद्धति के मानकीकरण की कमी तस्वीर को और भी जटिल बनाती है।
यह लेख एक संशोधित एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो मानव प्लाज्मा में α- और 3सीजीआरपी के शुद्धिकरण और सटीक परिमाणीकरण की अनुमति देता है। किट के एंटीबॉडी एमीलिन, कैल्सीटोनिन या पदार्थ पी के साथ क्रॉस-रिएक्टिव नहीं हैं। इस प्रोटोकॉल ने आवश्यक सत्यापन प्रयोगों से गुजरना पड़ा है, जैसे स्पाइक और रिकवरी और कमजोर पड़ने की रैखिकता, जिसके लिए डेटा यहां प्रस्तुत किया गया है। इस तरह के सीजीआरपी एलिसा प्रोटोकॉल जो सत्यापन से गुजरा है, पहले साहित्य में पूरी तरह से वर्णित नहीं किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग माइग्रेन के साथ-साथ कार्डियोलॉजिक2,25, त्वचाविज्ञान 26, प्रसूति27, रुमेटोलॉजी28,29, मस्कुलोस्केलेटल30,31, अंतःस्रावी 32,33, और वायरल रोगों 12,13 के संदर्भ में मानव प्लाज्मा में सीजीआरपी को मापने के लिए किया जा सकता है, जिसमें सीजीआरपी को फंसाया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह आलेख मानव प्लाज्मा में सीजीआरपी का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए अनुमति देने वाले एक मान्य प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। वाणिज्यिक सीजीआरपी एलिसा किट को इस अणु को सटीक रूप से निर्धारित नहीं करने के ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल के बारे में उनकी उपयोगी चर्चाओं के लिए रॉबर्ट एन कोल, लॉरेन आर डेविन और मार्कोस इग्लेसियस को धन्यवाद देना चाहते हैं। यह अमेरिकन ओटोलॉजिकल सोसाइटी (फैलोशिप ग्रांट, पीएसके), अमेरिकन हियरिंग रिसर्च फाउंडेशन (90066548/90072266, जेपीसी), और नेशनल सेंटर फॉर एडवांसट्रांसलेशनल साइंसेज (एनसीएटीएस), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) के एक घटक और एनआईएच रोडमैप फॉर मेडिकल रिसर्च (यूएल 1 टीआर 003098, एनएसएफ) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित था। प्रकाशन की सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि जॉन्स हॉपकिंस आईसीटीआर, एनसीएटीएस या एनआईएच के आधिकारिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करें।
Materials
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus – Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
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