עכבר ב- Vivo שליה ממוקד מניפולציה CRISPR

השליה היא איבר חיוני המעורב בהתפתחות העובר. תפקידה העיקרי של השליה הוא לספק גורמים חיוניים ולווסת את העברת החומרים המזינים והפסולת אל העובר וממנו. שליות יונקים מורכבות הן מרקמה עוברית והן מרקמה אימהית, המרכיבות את הממשק העוברי-אימהי, ולכן הגנטיקה של האם והעובר משפיעה על הפונקציה¹. אנומליות גנטיות או תפקוד לקוי של השליה יכולים לשנות באופן דרסטי את התפתחות העובר. עבודות קודמות הראו כי גנטיקה והתפתחות שליה קשורות להתפתחות משתנה של מערכות איברים ספציפיות בעובר. בפרט, הפרעות בשליה קשורות לשינויים במוח, בלב ובמערכת כלי הדם של העובר 2,3,4,5.

העברת הורמונים, גורמי גדילה ומולקולות אחרות מהשליה לעובר ממלאת תפקיד מרכזי בהתפתחות העובר⁶. הוכח כי שינוי ייצור השליה של מולקולות ספציפיות יכול לשנות את ההתפתחות העצבית. דלקת אימהית יכולה להגביר את ייצור הסרוטונין על ידי שינוי ביטוי הגן המטבולי טריפטופן (TRP) בשליה, אשר לאחר מכן יוצר הצטברות של סרוטונין במוח העובר⁷. מחקרים אחרים מצאו מומים בשליה לצד מומי לב. הפרעות בשליה נחשבות כתורמות למומי לב מולדים, המום המולד, השכיח ביותר בבני אדם⁸. מחקר שנערך לאחרונה זיהה מספר גנים בעלי מסלולים תאיים דומים הן בשליה והן בלב. אם הם משובשים, מסלולים אלה עלולים לגרום לפגמים בשני האיברים⁹. המומים בשליה עלולים להחמיר מומי לב מולדים. תפקידה של גנטיקה של השליה ותפקודה על התפתחות מערכת איברים עוברית ספציפית הוא תחום מחקר מתפתח.

לעכברים יש שליות המוכריאליות ותכונות אחרות של שליות אנושיות, מה שהופך אותם למודלים שימושיים ביותר לחקר מחלות אנושיות¹. למרות חשיבותה של השליה, חסרות כיום מניפולציות גנטיות ממוקדות in vivo. יתר על כן, יש כיום יותר אפשרויות זמינות עבור נוקאאוטים או נוק-דאונים מאשר ביטוי יתר או מניפולציות רווח של פונקציה בשליה¹⁰. ישנם מספר קווים טרנסגניים למניפולציה ספציפית לשליה, כל אחד בשושלות טרופובלסטים שונות בנקודות זמן שונות. אלה כוללים Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER ו- Gcm1-Cre 11,12,13,14. בעוד טרנסגנים Cre אלה יעילים, הם עשויים שלא להיות מסוגלים לתפעל גנים מסוימים בנקודות זמן ספציפיות. שיטה נפוצה נוספת לביטוי גנים של שליה היא החדרת וקטורים לנטי-ויראליים לתרבית בלסטוציסט, מה שגורם למניפולציה גנטית ספציפית לטרופובלסט^15,16. טכניקה זו מאפשרת שינוי משמעותי בביטוי גן השליה בשלב מוקדם בהתפתחות. השימוש בהפרעות RNA in vivo נוצל בדלילות בשליה. החדרת פלסמידים shRNA יכולה להתבצע באופן דומה לטכניקת CRIPSR המתוארת במאמר זה. זה נעשה ב E13.5 כדי להפחית בהצלחה את ביטוי PlGF בשליה, עם השפעות על כלי הדם במוח של צאצאים¹⁷.

בנוסף לטכניקות המשמשות בעיקר לנוקאאוט או להדחה, גרימת ביטוי יתר מבוצעת בדרך כלל עם אדנווירוסים או החדרת חלבון אקסוגני. לטכניקות המשמשות לביטוי יתר יש שיעורי הצלחה משתנים והן בוצעו לרוב בשלב מאוחר יותר בהריון. כדי לחקור את תפקידו של גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1) בתפקוד השליה, בוצעה העברת גן שליה בתיווך אדנובירל כדי לגרום לביטוי יתר של הגן IGF-1 ^18,19. זה בוצע מאוחר בהריון עכבר על E18.5 באמצעות הזרקת שליה ישירה. כדי לספק אפשרויות נוספות ולעקוף כשלים אפשריים של מניפולציות גנטיות מבוססות של שליה, כגון כשלים משולבים של Cre-Lox, הרעילות האפשרית של אדנווירוסים, וההשפעות מחוץ למטרה של shRNA, ניתן להשתמש במניפולציה ישירה של CRISPR in vivo של השליה 20,21,22. מודל זה פותח כדי לתת מענה להיעדר מודלים של ביטוי יתר וליצור מודל עם גמישות.

טכניקה זו מבוססת על עבודתם של Lecuyer et al., שבה פלסמידים shRNA ו- CRISPR כוונו ישירות in vivo לשליות עכבר כדי לשנות ביטוי PlGF ¹⁷. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לשנות ישירות את ביטוי גני השליה באמצעות מניפולציה של CRISPR במספר נקודות זמן; עבור עבודה זו, E12.5 נבחר. השליה התבגרה בשלב זה והיא גדולה מספיק כדי לבצע מניפולציות, מה שמאפשר החדרת פלסמיד CRISPR ספציפי על E12.5, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על התפתחות העובר מאמצע עד סוף ההריון^23,24. בניגוד לגישות טרנסגניות, אך בדומה להשראות נגיפיות או הפרעות RNA, טכניקה זו מאפשרת ביטוי יתר או נוקאאוט בנקודות זמן מסוימות באמצעות גישה כירורגית מתקדמת יחסית, ובכך מונעת שליה לקויה אפשרית או קטלניות עוברית משינויים מוקדמים יותר. מכיוון שרק שליות מעטות מקבלות את פלסמיד הניסוי או הבקרה בתוך המלטה, הגישה מאפשרת שני סוגים של בקרות פנימיות. בקרות אלה הן אלה המוזרקות ומתחשמלות עם פלסמיד הבקרה המתאים ואלה שאינן מקבלות מניפולציה ישירה. טכניקה זו הותאמה ליצירת ביטוי יתר של הגן IGF-1 בשליית העכבר באמצעות פלסמיד CRISPR מתווך הפעלה סינרגיסטי (SAM). הגן IGF-1 נבחר, שכן IGF-1 הוא הורמון גדילה חיוני המועבר לעובר ומיוצר בעיקר בשליה לפני הלידה^25,26. טכניקת CRISPR חדשה ממוקדת שליה זו תאפשר מניפולציה ישירה שתסייע להגדיר את הקשר בין תפקוד השליה להתפתחות העובר.