Microdisección y microscopía electrónica de barrido de montaje completo Visualización del plexo coroideo del ratón

Las barreras estrechas separan el sistema nervioso central (SNC) de la periferia, incluida la barrera hematoencefálica (BBB) y la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (LCR). Estas barreras protegen el SNC contra insultos externos y aseguran un microambiente equilibrado y controlado ^1,2,3. Si bien la barrera hematoencefálica se ha estudiado ampliamente a lo largo del tiempo, la barrera sangre-LCR ubicada en el plexo coroideo (PC) solo ha ganado un creciente interés de investigación durante la última década. Esta última barrera se puede encontrar en los cuatro ventrículos del cerebro (Figura 1A, B) y se caracteriza por una sola capa de células epiteliales del plexo coroideo (CPE) que rodean un estroma central, capilares con fugas, fibroblastos y una población de células linfoides y mieloides (Figura 1C)^4,5,6. Las células CPE están firmemente interconectadas por uniones estrechas, evitando así la fuga de los capilares sanguíneos fenestrados subyacentes hacia el LCR y el cerebro. Además, el transporte a través de las células CPE está regulado por una serie de sistemas de transporte hacia adentro y hacia afuera que manejan la afluencia de compuestos beneficiosos (por ejemplo, nutrientes y hormonas) de la sangre al LCR y el flujo de salida de moléculas dañinas (por ejemplo, desechos metabólicos, exceso de neurotransmisores) en la otra dirección ^1,6. Para poder ejercer su función de transporte activo, las células CPE contienen numerosas mitocondrias en su citoplasma⁷. Además, el PC es la principal fuente de LCR y actúa como el guardián del cerebro por la presencia de células inflamatorias residentes¹. Debido a su ubicación única entre la sangre y el cerebro, el PC también está perfectamente posicionado para llevar a cabo la vigilancia inmune⁸.

Figura 1: Descripción esquemática de la ubicación y composición del plexo coroideo (PC). El tejido CP (A, B) se encuentra dentro de los dos ventrículos laterales, tercero y cuarto de (A) cerebro humano y (B) de ratón. (C) El tejido CP consiste en una sola capa de células de epitelio CP cuboidal (CPE) estrechamente conectadas que rodean los capilares fenestrados, el tejido conectivo suelto y las células linfoides y mieloides, y forma la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (adaptada y modificada de la referencia²³). Figura creada con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Durante la última década, la creciente evidencia, incluyendo varios informes de nuestro grupo de investigación, han revelado que la PC juega un papel central en la salud y la enfermedad 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Por ejemplo, se sabe que la barrera sangre-LCR envejecida presenta alteraciones morfológicas en, entre otros, los núcleos, las microvellosidades y la membrana basal ^1,19. Además, en el contexto de la enfermedad de Alzheimer, la integridad general de la barrera se ve comprometida y todos estos cambios relacionados con la edad parecen ser aún más pronunciados ^1,8,20. Además de los cambios morfológicos, el transcriptoma, el proteoma y el secretoma del PC se alteran durante la enfermedad ^12,21,22,23. Por lo tanto, el conocimiento avanzado de la PC es esencial para comprender mejor su papel en las enfermedades neurológicas y potencialmente desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.

Un método eficiente para la microdisección precisa de la PC fuera de los ventrículos cerebrales es el primer paso invaluable para permitir la investigación adecuada de esta pequeña estructura cerebral. Debido a su naturaleza altamente vascularizada (Figura 2B), el PC que flota dentro de las cavidades ventriculares del cerebro se puede identificar utilizando un microscopio binocular. Sin embargo, a menudo se requiere perfusión transcárdica para el análisis posterior, lo que complica la identificación y el aislamiento adecuados del tejido CP (Figura 2C). Si los pasos de procesamiento adicionales lo permiten (por ejemplo, en el caso del análisis de ARN y proteínas), el PC se puede visualizar mediante perfusión transcárdica con azul de bromofenol (Figura 2A). Varias publicaciones ya describen el aislamiento del PC de cerebros de ratas²⁴ y crías de ratón²⁵. Aquí, se describe una técnica de aislamiento de microdisección para aislar el PC de ratones adultos. Es importante destacar que esta técnica de aislamiento preserva la viabilidad, función y estructura de las células dentro del PC. Aquí se describe el aislamiento del PC flotando en el cuarto ventrículo y lateral. En resumen, los ratones son anestesiados terminalmente y, si es necesario, perfundidos transcárdicamente. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la perfusión puede dañar la estructura de las células dentro de la PC. En consecuencia, si la muestra se va a analizar utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie (SBF-SEM) o SEM de haz de iones enfocado (FIB-SEM), no se debe realizar perfusión. A continuación, se aísla todo el cerebro y se utilizan fórceps para hemisectar sagitalmente el cerebro. A partir de aquí, los PC que flotan en los ventrículos laterales se pueden identificar y diseccionar, mientras que el PC del cuarto ventrículo se puede aislar del lado cerebeloso del cerebro.

Figura 2: Visualización del plexo coroideo (PC) del ventrículo lateral (A-C) y (D-F) después de la perfusión (A,D) de azul de bromofenol, (B,E) sin perfusión y (C,F) con PBS/heparina. Las imágenes se toman con un microscopio estéreo (aumento de 8x-32x). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una vez que el PC se disecciona adecuadamente de los ventrículos cerebrales, se puede aplicar todo un repertorio de técnicas para obtener una mayor comprensión de la función de esta estructura. Por ejemplo, la citometría de flujo o la secuenciación de ARN unicelular pueden realizarse para cuantificar y analizar fenotípicamente las células inflamatorias infiltrantes bajo ciertas condiciones de enfermedad^26,27. Además de la composición celular, la composición molecular del PC puede analizarse para evaluar la presencia de citoquinas y quimiocinas mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoblot o mediante análisis simultáneo de múltiples citoquinas utilizando la matriz de perlas de citoquinas²⁸. Además, se pueden realizar análisis de transcriptoma, vascular, histología de células inmunes y secretoma en los explantes de CP microdisecados²⁹. Aquí, la microscopía electrónica de barrido (SEM) en CP de montaje completo se utiliza para obtener una visión general de la estructura CP. SEM utiliza un haz de electrones enfocados para escanear sobre la superficie y crear una imagen de la topografía y composición de la superficie. Dado que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de la luz, la resolución de SEM está en el rango nanométrico y es superior a la de un microscopio óptico. En consecuencia, los estudios morfológicos a nivel subcelular se pueden realizar a través de SEM. Brevemente, el CP disecado se transfiere inmediatamente a un fijador que contiene glutaraldehído para una fijación durante la noche, seguida de osmicación y tinción de acetato de uranilo. Luego, las muestras se tratan con tinción de aspartato de plomo, se deshidratan y, en última instancia, se incrustan para obtener imágenes.

Por lo tanto, este protocolo facilita el aislamiento eficiente de la PC de los ventrículos cerebrales del ratón, que se pueden analizar más a fondo utilizando una variedad de técnicas posteriores para investigar su estructura y función.