ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में अंतर्जात जीन टैगिंग के लिए एक-चरण सीआरआईएसपीआर-आधारित रणनीति

फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीवित जीवों ^1,2 के भीतर कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानीयकरण, गतिशीलता, और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत visualizing के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा ^है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ अंतर्जात जीन टैगिंग उपकोशिकीय संकल्प के साथ सेलुलर प्रक्रियाओं की दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इन अंतर्जात जीन-लेबलिंग तकनीकों में अतिअभिव्यक्ति और इम्यूनोस्टेनिंग दृष्टिकोण की तुलना में कई फायदे हैं। उदाहरण के लिए, प्रोटीन की overexpression प्रोटीन misfolding, निरर्थक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत, और mislocalization³ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. तिथि करने के लिए, शोधकर्ताओं इस तरह के नवोदित खमीर, जो कुशल homologous पुनर्संयोजन⁴ से गुजरना कर सकते हैं के रूप में कुछ मॉडल जीवों, के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े अंतर्जात जीन के विशाल पुस्तकालयों का निर्माण करने में सक्षम किया गया है. ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के मामले में, एमआईएमआईसी⁵, ट्रांसपोसॉन-आधारित एन्हांसर ट्रैप⁶, और फॉस्मिड्स⁷ जैसे विभिन्न उपकरण जीन को फ्लोरोसेंटली टैग करने के लिए तैयार किए गए हैं।

सीआरआईएसपीआर-कैस 9-आधारित उपकरणों के विकास ने मॉडल जीव ^8,9 की एक विस्तृत श्रृंखला में अंतर्जात प्रोटीन को टैग करने सहित जीनोम संपादन को कुशलतापूर्वक करना संभव बना दिया ^है। Cas9 एक आरएनए-निर्देशित एंजाइम है जो अत्यधिक कुशल और विशिष्ट तरीके से डबल-फंसे डीएनए को क्लीवेज करता है⁸, जिसे तब एक गैर-समरूप अंत-जुड़ने (NHEJ) मार्ग द्वारा मरम्मत की जा सकती है जिससे बिंदु उत्परिवर्तन या विलोपन होता है। वैकल्पिक रूप से, होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) मार्ग गुणसूत्र में विषम डीएनए के एकीकरण की अनुमति देता है।

मॉडल जीव में सीआरआईएसपीआर आधारित जीन टैगिंग के लिए पिछले विधियों, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, एक दो कदम प्रक्रिया^{10,11,12पर} भरोसा किया है. इसमें सफल एचडीआर घटनाओं का पता लगाने के लिए एक स्पष्ट आंखों के रंग मार्कर, डीएसरेड का उपयोग करना शामिल है। बाद में, Dsred मार्कर को Cre/loxP पुनर्संयोजन प्रणाली का उपयोग करके निकाला जाएगा। इस प्रक्रिया को सुव्यवस्थित और तेज करने के लिए, यहां, हम एक सरल और अधिक कुशल तरीका प्रस्तुत करते हैं। यह दृष्टिकोण घातक जीनोटाइपिंग की आवश्यकता को दरकिनार करता है और व्यक्तिगत मक्खियों की प्रत्यक्ष जांच की अनुमति देता है। विशेष रूप से, हम मक्खी के मध्य पैर के एक छोटे से खंड से डीएनए निकालने के लिए एक पीसीआर आधारित दृष्टिकोण को रोजगार, हमें व्यक्तिगत मक्खियों जीनोटाइप करने के लिए अनुमति देता है. विशेष रूप से, यह प्रक्रिया नमूना मक्खी की जीवन शक्ति, आंदोलन या प्रजनन क्षमताओं से समझौता नहीं करती है। इस पद्धति के माध्यम से पहचाने जाने वाले केवल उपयुक्त व्यक्तियों को ही स्थिर स्टॉक में विकसित किया जाता है।

यहां, हम फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग मक्खियों को उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें अंतर्जात जीन फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ लेबल किए जाते हैं। यह तकनीक किसी भी वांछित फ्लोरोफोर टैग को एक अंतर्जात जीन के एन- या सी-टर्मिनल में फ्यूज करने के लिए सीआरआईएसपीआर-कैस 9 जीनोम संपादन का उपयोग करती है। नीचे, हम जीआरएनए प्लास्मिड और एक दाता प्लास्मिड के डिजाइन और निर्माण का वर्णन करते हैं, सीआरआईएसपीआर-पॉजिटिव मक्खियों का चयन करने के लिए एक-चरण स्क्रीनिंग रणनीति, और स्थिर लाइनों को स्थापित करने के लिए कदम। विशेष रूप से, हम सी-टर्मिनल पर फ्लोरोफोर के साथ एक अंतर्जात कोर घड़ी ड्रोसोफिला जीन, अवधि को टैग करने के लिए रणनीतियों का वर्णन करते हैं। हम भी संक्षेप में नियंत्रण प्रयोगों है कि टैग प्रोटीन कार्यात्मक और जिंदा इमेजिंग तकनीक बरकरार ड्रोसोफिला दिमाग¹³ के भीतर रहते घड़ी न्यूरॉन्स में अवधि प्रोटीन कल्पना करने के लिए पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया जा करने की आवश्यकता का वर्णन. यहां वर्णित प्रोटोकॉल सीआरआईएसपीआर-कैस 9 जीनोम संपादन द्वारा डीएनए के विशिष्ट बिट्स के विलोपन और सम्मिलन के लिए स्क्रीन उम्मीदवारों पर भी व्यापक रूप से लागू होता है।