הדמיה תוך חיונית של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בעכברים עם פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה וחלון גולגולת באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני
Summary
מחקר זה מדגים העברה של פגיעה מוחית טראומטית חוזרת ונשנית לעכברים והשתלה סימולטנית של חלון גולגולתי לצורך הדמיה תוך-חיונית עוקבת של EGFP המתבטא בנוירונים באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים.
Abstract
מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לדמיין לאורך זמן את הביטוי והלוקליזציה של חלבון מעניין בתוך סוגי תאים ספציפיים במוחו של בעל חיים, בעת חשיפה לגירויים אקסוגניים. כאן מוצג ניהול של פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה (TBI) והשתלה סימולטנית של חלון גולגולתי לצורך הדמיה תוך-חיונית אורכית עוקבת בעכברים. עכברים מוזרקים תוך גולגולתית עם וירוס הקשור לאדנו (AAV) המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) תחת מקדם ספציפי לנוירונים. לאחר 2 עד 4 שבועות, העכברים עוברים TBI חוזר ונשנה באמצעות מכשיר ירידה במשקל מעל מיקום הזרקת AAV. באותו ניתוח משתילים את העכברים עמוד ראש מתכתי ולאחר מכן חלון גולגולת זכוכית מעל אתר הפגיעה בפגיעה מוחית טראומטית. הביטוי והמיקום התאי של EGFP נבדקים באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים באותו אזור במוח שנחשף לטראומה במשך חודשים.
Introduction
פגיעה מוחית טראומטית (TBI), שיכולה לנבוע מפציעות ספורט, התנגשויות בכלי רכב ולחימה צבאית, היא דאגה בריאותית עולמית. פגיעה מוחית טראומטית יכולה להוביל לליקויים פיזיולוגיים, קוגניטיביים והתנהגותיים, ולנכות או תמותה לכל החיים 1,2. חומרת TBI יכולה להיות מסווגת כקלה, בינונית וחמורה, כאשר הרוב המכריע הוא TBI קל (75%-90%)3. יותר ויותר מכירים בכך שפגיעה מוחית טראומטית, במיוחד התרחשויות חוזרות ונשנות של TBI, יכולה לקדם ניוון עצבי ולשמש כגורמי סיכון למספר מחלות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת אמיוטרופית צידית (ALS), דמנציה פרונטוטמפורלית (FTD) ואנצפלופתיה טראומטית כרונית (CTE)4,5,6. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ניוון עצבי הנגרם על-ידי TBI עדיין אינם ברורים, ולכן הם מייצגים תחום מחקר פעיל. כדי לקבל תובנה לגבי האופן שבו תאי עצב מגיבים לפגיעה מוחית טראומטית ומתאוששים ממנה, שיטה לניטור חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי של עניין, במיוחד בתוך תאי עצב, באמצעות הדמיה תוך-חיונית אורכית בעכברים לאחר TBI מתוארת כאן.
לשם כך, מחקר זה מראה כיצד לשלב הליך כירורגי למתן TBI בגולגולת סגורה הדומה למה שדווח בעבר7,8, יחד עם הליך כירורגי להשתלת חלון גולגולתי לדימות תוך חיוני במורד הזרם, כפי שתואר על ידי Goldey et al9. יש לציין כי אין זה ריאלי להשתיל תחילה חלון גולגולתי ולאחר מכן לבצע TBI באותו אזור, שכן ההשפעה של ירידת המשקל שגורמת לפגיעה מוחית טראומטית עלולה לפגוע בחלון ולגרום נזק בלתי הפיך לעכבר. לכן, פרוטוקול זה תוכנן לנהל את הפגיעה המוחית טראומטית ולאחר מכן להשתיל את חלון הגולגולת ישירות מעל אתר הפגיעה, והכל באותו מפגש כירורגי. יתרון בשילוב של TBI והשתלת חלון גולגולתי בפגישה כירורגית אחת הוא הפחתה במספר הפעמים שעכבר נתון לניתוח. יתר על כן, היא מאפשרת לאדם לעקוב אחר התגובה המיידית (כלומר, על ציר הזמן של שעות) לפגיעה מוחית טראומטית, בניגוד להשתלת החלון בפגישה כירורגית מאוחרת יותר (כלומר, הדמיה ראשונית שמתחילה בסקאלת זמן של ימים לאחר TBI). חלון הגולגולת ופלטפורמת הדימות התוך חיונית מציעים גם יתרונות על פני ניטור חלבונים עצביים בשיטות קונבנציונליות כגון צביעה חיסונית של רקמות קבועות. לדוגמה, פחות עכברים נדרשים לדימות תוך-חיוני, מכיוון שניתן לחקור את אותו עכבר במספר נקודות זמן, בניגוד לקבוצות נפרדות של עכברים הדרושות לנקודות זמן נפרדות. יתר על כן, אותם נוירונים יכולים להיות מנוטרים לאורך זמן, המאפשר אחד לעקוב אחר אירועים ביולוגיים או פתולוגיים ספציפיים בתוך אותו תא.
כהוכחת היתכנות, הביטוי הספציפי לנוירון של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) תחת מקדם הסינפסינים מודגם כאן10. גישה זו יכולה להיות מורחבת ל 1) סוגים שונים של תאי מוח על ידי שימוש במקדמים ספציפיים אחרים לסוג התא, כגון מקדם חלבון בסיסי מיאלין (MBP) עבור אוליגודנדרוציטים ומקדם חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP) עבור אסטרוציטים11, 2) חלבוני מטרה שונים בעלי עניין על ידי מיזוג הגנים שלהם עם הגן EGFP, ו -3) ביטוי משותף של חלבונים מרובים המאוחים לפלואורופורים שונים. כאן, EGFP נארז ומתבטא באמצעות משלוח וירוס הקשור אדנו (AAV) באמצעות זריקה תוך גולגולתית. TBI בעל גולגולת סגורה מנוהל באמצעות מכשיר לירידה במשקל, ואחריו השתלה של חלון גולגולתי. הדמיה של EGFP עצבי מושגת דרך חלון הגולגולת, באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים כדי לזהות פלואורסצנטיות EGFP in vivo. עם לייזר שני פוטונים, ניתן לחדור עמוק יותר לתוך רקמת קליפת המוח עם נזק פוטוגרפי מינימלי, המאפשר הדמיה אורכית חוזרת ונשנית של אותם אזורים בקליפת המוח בתוך עכבר בודד במשך ימים ועד חודשים12,13,14,15. לסיכום, גישה זו של שילוב ניתוח TBI עם הדמיה תוך-חיונית שואפת לקדם את ההבנה של האירועים המולקולריים התורמים לפתולוגיה של מחלות המושרות על ידי TBI16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, הזרקת AAV, מתן TBI ועמוד ראש עם השתלת חלון גולגולתי שולבו לצורך ניתוח הדמיה אורכית של תאי עצב המסומנים בתווית EGFP בתוך קליפת המוח של העכבר (שכבות IV ו-V) כדי לבחון את ההשפעות של TBI על נוירונים בקליפת המוח. מחקר זה מציין כי אתר TBI שנבחר כאן, מעל ההיפוקמפוס, מספק משטח שטוח ורחב יחסית להשתלת חל…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר מיגל סנה-אסטבס מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ’וסטס צ’אן על הענקת נגיף AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, ולדברה קמרון מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ’וסטס צ’אן על ציור שרטוט גולגולת העכברים. אנו מודים גם לחברים בהווה ובעבר במעבדות בוסקו, שפר והנינגר על הצעותיהם ותמיכתם. עבודה זו מומנה על ידי משרד ההגנה (W81XWH202071/PRARP) ל-DAB, DS ו-NH.
Materials
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
Referências
- Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
- National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. . Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).
- Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
- Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
- von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
- White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
- Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
- Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
- Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
- Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
- Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicina. 99 (32), 21601 (2020).
- Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
- Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).
