Ensayo de sedimentación basado en concanavalina A para medir la unión al sustrato de las fosfatasas de glucano

Las fosfatasas de glucano son miembros de una subfamilia funcionalmente diversa de fosfatasas de especificidad dual (DSP) dentro de la superfamilia¹ de la proteína tirosina fosfatasa (PTP). Se han encontrado en la mayoría de las formas de vida, incluyendo organismos fotosintéticos ampliamente divergentes, humanos, vertebrados y algunos invertebrados y protistas ^2,3,4. Las plantas contienen tres fosfatasas de glucano conocidas: Almidón Exceso4 (SEX4), Como Sexo Cuatro1 (LSF1) y Como Sexo Cuatro2 (LSF2)^5,6,7. Las plantas que carecen de glucano fosfatasas muestran tasas disminuidas de degradación transitoria del almidón y acumulación de almidón en las hojas ^8,9. Laforin es el miembro fundador de la familia glucano fosfatasa que desfosforila glucógeno en vertebrados y humanos ^3,10. Las mutaciones de laforina resultan en la enfermedad neurodegenerativa de Lafora, una forma autosómica recesiva fatal de epilepsia¹¹. Las glucano fosfatasas son necesarias para el metabolismo del glucógeno y del almidón y han surgido como enzimas importantes para modular el contenido de almidón en las plantas y tratar la enfermedad neurodegenerativa de Lafora^12,13. Estudios recientes de cristalografía de rayos X sobre fosfatasas de glucano con sustratos de glucano modelo han arrojado luz sobre la unión al sustrato y el mecanismo catalítico de la desfosforilación de glucanos^14,15,16,17. Sin embargo, la comprensión actual de cómo las fosfatasas de glucano se unen a sus sustratos fisiológicos es incompleta.

El almidón es un polímero insoluble de glucosa hecho de 80% -90% de amilopectina y 10% -20% de amilosa¹⁸. Los sustratos para las fosfatasas de glucano vegetal son moléculas de carbohidratos fosforilados, como el glucógeno y los gránulos de almidón. Los residuos de glucosilo fosforilados están presentes en una proporción de 1:600 fosfato:residuo de glucosil. Curiosamente, los fosfatos están presentes sólo en las moléculas de amilopectina¹⁹. La principal glucano fosfatasa de la planta SEX4 actúa sobre el gránulo de almidón para desfosforilar las moléculas de amilopectina. La estructura cristalina de rayos X de SEX4 combinada con estudios de mutagénesis guiada por estructura ha demostrado las especificidades únicas del sustrato de SEX4 para diferentes posiciones dentro de una estructura de glucano¹⁵. Recientemente hemos demostrado que la actividad biológicamente relevante de SEX4 sólo puede observarse cuando actúa sobre sus sustratos de amilopectina solubilizados²⁰. Sin embargo, comprender las interacciones glucano-SEX4 ha demostrado ser difícil debido a la complejidad estructural del sustrato, las especificidades de unión más amplias y las bajas afinidades de unión entre la proteína y sus sustratos. Estos problemas han obstaculizado la capacidad de utilizar métodos comúnmente utilizados en las interacciones proteína-ligando, como la calorimetría de titulación isotérmica (ITC), la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) y los ensayos basados en ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA).

Curiosamente, gran parte de nuestra comprensión de las interacciones carbohidratos-proteínas proviene del estudio de las lectinas. La concanavalina A (ConA) es una familia de proteínas lectinas de leguminosas originalmente extraídas del frijol jack. ConA se une a los carbohidratos con alta especificidad, lo que es ventajoso para su uso en aplicaciones de administración y orientación de fármacos. La unión de ConA a una variedad de sustratos que contienen α-D-manosil y α-D-glucosilo no reductores ha sido ampliamente estudiada^19,20. Las perlas de sefarosa unidas a ConA disponibles comercialmente se usan comúnmente para purificar glicoproteínas y glicolípidos²¹. ConA se une a estos glucanos a través de los grupos hidroxilo C3, C4 y C6 de los residuos de glucosa. Las perlas de ConA-Sepharose también se han utilizado con éxito para medir la unión de las interacciones glucógeno-proteína y almidón-proteína^22,23. En este estudio, utilizamos perlas de ConA-Sepharose para desarrollar un ensayo de unión para medir las especificidades de unión de las interacciones glucano fosfatasa-amilopectina.

Anteriormente, se empleó un ensayo de sedimentación basado en ConA para evaluar la capacidad de unión al sustrato de glucano fosfatasa^14,20,24. En este estudio, se utilizó la misma estrategia para desarrollar un método novedoso para determinar la afinidad de unión de las interacciones glucano-glucano fosfatasa y carbohidratos. Este método también tiene una ventaja para investigar varias interacciones carbohidratos-proteínas solubilizadas.