Detección de espermatozoides para el aislamiento rápido de ediciones de la línea germinal en el pez cebra
Summary
Las tecnologías CRISPR-Cas han revolucionado el campo de la edición del genoma. Sin embargo, encontrar y aislar la edición de la línea germinal deseada sigue siendo un cuello de botella importante. Por lo tanto, este protocolo describe un método robusto para examinar rápidamente el esperma de pez cebra inyectado con CRISPR F0 para ediciones de la línea germinal utilizando técnicas estándar de PCR, digestión de restricción y electroforesis en gel.
Abstract
El advenimiento de las tecnologías de nucleasa CRISPR-Cas dirigidas ha revolucionado la capacidad de realizar una edición precisa del genoma en sistemas modelo establecidos y emergentes. Los sistemas de edición del genoma CRISPR-Cas utilizan un ARN guía sintético (sgRNA) para dirigir una endonucleasa asociada a CRISPR (Cas) a loci de ADN genómico específico, donde la endonucleasa Cas genera una ruptura de doble cadena. La reparación de roturas de doble cadena mediante mecanismos intrínsecos propensos a errores conduce a inserciones y / o eliminaciones, interrumpiendo el locus. Alternativamente, la inclusión de donantes de ADN bicatenario u oligonucleótidos de ADN monocatenario en este proceso puede provocar la inclusión de ediciones precisas del genoma que van desde polimorfismos de un solo nucleótido hasta pequeñas etiquetas inmunológicas o incluso grandes construcciones de proteínas fluorescentes. Sin embargo, un cuello de botella importante en este procedimiento puede ser encontrar y aislar la edición deseada en la línea germinal. Este protocolo describe un método robusto para detectar y aislar mutaciones de la línea germinal en loci específicos en Danio rerio (pez cebra); Sin embargo, estos principios pueden ser adaptables en cualquier modelo donde sea posible la recolección de espermatozoides in vivo .
Introduction
El sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas es una poderosa herramienta para realizar mutagénesis específica de loci y edición precisa del genoma en el sistema modelo Danio rerio (pez cebra) 1,2,3,4. La Cas-ribonucleoproteína (RNP) está compuesta por dos componentes principales: una endonucleasa Cas (comúnmente Cas9 o Cas12a) y un ARN guía sintético específico del locus (sgRNA)5. Juntos, el Cas-RNP genera una rotura de doble cadena (DSB) en el locus deseado que puede ser reparada por uno de los dos mecanismos de reparación intrínsecos. El mecanismo de reparación de unión de extremos no homólogos (NHEJ) es propenso a errores y a menudo resulta en una variedad de inserciones o eliminaciones (indeles) alrededor del DSB. Estos indeles pueden ser perjudiciales si introducen una mutación de cambio de marco o una parada prematura en la secuencia de proteínas resultante. Alternativamente, el mecanismo de reparación dirigida por homología (HDR) utiliza una plantilla de donante con regiones de homología que rodean el sitio DSB para reparar el daño. Los investigadores pueden aprovechar el sistema HDR para generar ediciones genómicas precisas. Específicamente, pueden coinyectar una construcción donante de ADN de doble cadena que contiene las ediciones deseadas, así como las regiones de homología que flanquean el sitio DSB en el genoma. El aumento de la economía de escala para estos componentes CRISPR producidos comercialmente ha reducido en gran medida las barreras para la detección de múltiples loci y para establecer esfuerzos a mayor escala para la edición precisa del genoma. Sin embargo, en modelos animales que se reproducen sexualmente, un cuello de botella importante es la identificación y el aislamiento de animales mutantes estables en la línea germinal.
El sistema modelo de pez cebra exhibe varias cualidades clave que mejoran su uso en estudios genéticos inversos. Son fáciles de criar en grandes cantidades con equipos básicos de alojamiento acuático, y las hembras exhiben una alta fecundidad durante todo el año6. Además, su puesta de huevos externa y fertilización los hacen susceptibles a la microinyección de componentes CRISPR / Cas. El Cas-RNP se inyecta comúnmente en embriones de pez cebra en etapa de una célula para generar DSB / reparación que, en teoría, es heredada por todas las células hijas. Sin embargo, los genomas diploides requieren dos eventos DSB/reparación para mutagenizar ambos cromosomas homólogos. Además, aunque Cas-RNP se inyecta en la etapa de una célula, el DSB/reparación puede no ocurrir hasta puntos posteriores en el desarrollo. Juntos, estos factores contribuyen a la naturaleza mosaica de los peces inyectados con F0. Una práctica común es cruzar peces inyectados con F0 y examinar a la progenie F1 en busca de indeles / ediciones específicas. Sin embargo, dado que no todos los peces inyectados con F0 poseen mutaciones de la línea germinal, esta práctica da como resultado muchos cruces improductivos que no generan la edición deseada. El cribado de la línea germinal F0 en lugar del tejido somático F1 aumenta la probabilidad de aislar la edición de la línea germinal deseada y reduce el número de animales requeridos en este proceso.
El esperma se puede recolectar fácilmente del pez cebra inyectado con F0 sin necesidad de eutanasia. Esta característica permite la criopreservación y rederivación de espermatozoides congelados7, pero también puede ser explotada para detectar, identificar y aislar rápidamente a los portadores de la línea germinal de las mutaciones genómicas deseadas 8,9. Brocal et al. (2016) describieron previamente un método basado en la secuenciación para detectar ediciones de la línea germinal en peces cebra machos inyectados con F010. Aunque es útil para identificar los alelos mutados presentes en la línea germinal, este enfoque puede llegar a ser costoso en alto rendimiento y puede no ser accesible para todos los laboratorios. En contraste, el protocolo actual ofrece una estrategia basada en electroforesis accesible y rentable para identificar ediciones de la línea germinal. Específicamente, este protocolo describe un método robusto para detectar y aislar mutaciones de la línea germinal en loci específicos utilizando electroforesis en gel de agarosa de alta resolución. Además, este protocolo describe una estrategia similar para identificar la integración exitosa de una construcción donante que contiene ediciones específicas. Como siempre, si se desean ediciones específicas, las estrategias basadas en secuenciación se pueden realizar en conjunto con el protocolo que se describe a continuación. Aunque este protocolo es específico del sistema modelo de pez cebra, estos principios deben ser adaptables a cualquier modelo en el que la recolección de esperma sea un procedimiento de rutina. Juntas, estas estrategias permitirán la identificación de machos inyectados con F0 con indeles/ediciones de la línea germinal que pueden resolverse en un gel después de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) estándar y / o la digestión de restricción.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método para caracterizar rápidamente ediciones putativas del genoma o mutaciones dirigidas utilizando la tecnología CRISPR-Cas mediante un análisis centrado en los genomas de espermatozoides masculinos F0. Este protocolo debe ser susceptible a otros modelos animales donde el esperma esté fácilmente disponible para el muestreo sin eutanasia. Este método aumentará el rendimiento de la detección de las ediciones deseadas y es especialmente útil para identificar eventos aleatorios raros m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Anna Hindes de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington por sus esfuerzos iniciales para obtener ADN genómico de esperma de buena calidad utilizando el método de inyección caliente. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de los Institutos Nacionales de Salud bajo Premio (R01AR072009 a R.S.G.).
Materials
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
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| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
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| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
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| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
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| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
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| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
Referências
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