طريقة تجانس سريعة وبسيطة وموحدة لإعداد مستحلبات المستضد / المستحلبات المساعدة لإحداث التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي
Summary
للحث على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي ، وهو نموذج حيواني للتصلب المتعدد ، يتم تحصين الفئران بمستحلب ماء في زيت يحتوي على مستضد ذاتي ومساعد فرويند كامل. في حين توجد عدة بروتوكولات لإعداد هذه المستحلبات ، يتم تقديم بروتوكول تجانس سريع وبسيط وموحد لإعداد المستحلب هنا.
Abstract
يشترك التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) في ميزات مناعية وسريرية مماثلة مع التصلب المتعدد (MS) ، وبالتالي يستخدم على نطاق واسع كنموذج لتحديد أهداف دوائية جديدة لعلاج أفضل للمرضى. يتميز مرض التصلب العصبي المتعدد بعدة دورات مرضية مختلفة: التصلب العصبي المتعدد الانتكاسي (RRMS) ، والتصلب المتعدد التقدمي الأولي (PPMS) ، والتصلب المتعدد التدريجي الثانوي (SPMS) ، وشكل نادر من الانتكاس التدريجي (PRMS). على الرغم من أن النماذج الحيوانية لا تحاكي بدقة كل هذه الأنماط الظاهرية المتناقضة للأمراض البشرية ، إلا أن هناك نماذج EAE تعكس بعض المظاهر السريرية المختلفة لمرض التصلب العصبي المتعدد. على سبيل المثال ، يحاكي البروتين السكري قليل التغصن الميالين (MOG) الذي يسببه EAE في الفئران C57BL / 6J PPMS البشري ، بينما يشبه بروتين المايلين البروتيني (PLP) الذي يسببه EAE في الفئران SJL / J RRMS. كما تستخدم المستضدات الذاتية الأخرى ، مثل بروتين المايلين الأساسي (MBP) ، وعدد من سلالات الفئران المختلفة لدراسة EAE. للحث على المرض في نماذج EAE للتحصين الذاتي ، يتم تحضير مستحلب الماء في الزيت وحقنه تحت الجلد. تتطلب غالبية نماذج EAE أيضا حقن سم السعال الديكي حتى يتطور المرض. من أجل تحريض EAE المتسق والقابل للتكرار ، من الضروري وجود بروتوكول مفصل لإعداد الكواشف لإنتاج مستحلب مستضد / مساعد. تستفيد الطريقة الموضحة هنا من طريقة موحدة لتوليد مستحلبات الماء في الزيت. إنه بسيط وسريع ويستخدم مجانس اهتزاز بدلا من المحاقن لإعداد مستحلبات يتم التحكم في جودتها.
Introduction
يمكن أن يؤدي انهيار التسامح المناعي إلى توليد اضطرابات المناعة الذاتية ، مثل التصلب المتعدد (MS). تشير التقديرات إلى أن 2.8 مليون شخص يعيشون مع مرض التصلب العصبي المتعدد في جميع أنحاء العالم1. على الرغم من أن السبب الدقيق لمرض التصلب العصبي المتعدد لا يزال غير معروف إلى حد كبير ، إلا أن عدم تنظيم الخلايا التائية والبائية ذاتية التفاعل ، بالإضافة إلى العيوب في وظيفة Treg ، تلعب أدوارا مهمة في التسبب في المرض 2,3.
النماذج الحيوانية لأمراض المناعة الذاتية هي أدوات أساسية للتحقيق في الطرائق العلاجية المحتملة. تم استخدام نموذج التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) منذ ما يقرب من قرن من قبل الباحثين المهتمين ب MS4. في التجارب المبكرة ، كان معدل الإصابة بالمرض منخفضا نسبيا. مكن إدخال مساعد فرويند الكامل (CFA) ، الذي يحتوي على المتفطرة وسم السعال الديكي ، من الحث المستمر ل EAE في الفئران4. الأهم من ذلك ، من الضروري خلط CFA مع مستضد خاص بالجهاز العصبي المركزي (CNS) لتوليد مستحلب متجانس من الماء في الزيت لتحفيز EAE. تعتمد نماذج EAE الأكثر شيوعا المتاحة حاليا على التحصين النشط للفئران بالببتيدات الدماغية. تلعب الخلفية الوراثية للفئران دورا مهما في القابلية للإصابة بالأمراض ، مع بروتين سكري المايلين قليل التغصن (MOG35-55) وبروتين المايلين البروتيني (PLP139-151) الببتيدات المستخدمة للحث على EAE في الفئران C57BL / 6J و SJL ، على التوالي5. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام سلالات الفئران الأخرى والببتيدات المشتقة من الجهاز العصبي المركزي.
تعد جودة مستحلب CFA / الببتيد عاملا حاسما يحدد اختراق المرض في نموذج EAEللتحصين النشط 6. يجب تحضير مستحلب متجانس من الماء في الزيت عن طريق خلط الببتيدات الدماغية المذابة في محلول مائي مع CFA ، وإلا فلن تصاب الحيوانات بالمرض. تم نشر العديد من البروتوكولات حول تحضير مستحلبات CFA / الببتيد. ومن الأمثلة على ذلك استخدام دوامة7 ، صوتنة8 ، محاقن وموصل Tثلاثي الاتجاهات 9 ، أو حقنة واحدة فقط5. ومع ذلك ، يصعب توحيد كل هذه الطرق وغالبا ما ترتبط ببروتوكولات طويلة ومعقدة.
بالمقارنة مع جميع الطرق المذكورة أعلاه ، فإن الطريقة البسيطة الموضحة هنا لإعداد المستحلب توفر مزايا عدم وجود اختلافات من شخص لآخر وكونها سريعة نسبيا. يتم إنشاء المستحلب بواسطة خالط يهز الكواشف بسرعة ووقت ودرجة حرارة محددة ، مما يضمن نتائج سريعة ومتسقة. بالإضافة إلى تحريض المرض في نموذج EAE ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لدراسة نماذج أمراض المناعة الذاتية الأخرى مثل التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين (CIA) والتهاب المفاصل الناجم عن المستضد (AIA)6. لذلك ، من المتوقع أن يتم استخدام هذه الطريقة للحث باستمرار على المرض في النماذج الحيوانية الأخرى التي تعتمد على مستحلبات الماء في الزيت مع المستضدات الذاتية ، مثل التهاب العصب المناعي الذاتي التجريبي (EAN)10 ، والتهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي التجريبي (EAT)11 ، والتهاب القزحية المناعي الذاتي (EAU)12 ، والوهن العضلي الوبيل (MG)13. تحفز هذه الطريقة أيضا استجابات مناعية عامة مثل فرط الحساسية من النوع المتأخر (DTH) باستمرار6 ، وبالتالي يمكن استخدامها لتوصيل لقاحات السرطان والملاريا (انظر المناقشة).
وبالتالي ، تم تطوير طريقة سريعة (إجمالي وقت التحضير ~ 30 دقيقة) ، بسيطة (يمكن تحضير جميع الكواشف مسبقا وتخزينها) ، وموحدة (يتم إنجاز المستحلب باستخدام خالط الاهتزاز) ويتم تقديمها هنا. مستحلبات CFA / المستضد المحضرة باستخدام هذا البروتوكول تحفز باستمرار المرض في نماذج المناعة الذاتية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام مستحلبات الماء في الزيت ، مثل مستضد / مساعد فرويند ، لأكثر من نصف قرن للحث على EAE17. لا توجد حاليا طريقة موحدة لإعداد مستحلبات المستضد مستقلة عن التأثير البشري. يعد الخلط اليدوي باستخدام المحاقن أمرا قياسيا لمعظم المختبرات ، ولكن هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا ، وغالب?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلف أن يعرب عن تقديره لوحدات إيواء الحيوانات في جامعة لوند ، كاميلا بيوركلوف وأغنيسكا تشوبيك ، لدعمهم ، وريتشارد ويليامز ، معهد كينيدي لأمراض الروماتيزم ، جامعة أكسفورد ، المملكة المتحدة ، للنقد البناء والدعم اللغوي لإنتاج هذه المخطوطة.
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
Referências
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells’ Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis–potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
