바이러스 전파 및 세포 기반 비색 정량화
Summary
본 프로토콜은 베로 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포에서 지카 바이러스(ZIKV)의 증식과 24웰 및 96웰(고처리량) 형식의 세포 기반 비색 면역검출 방법을 사용한 ZIKV의 정량화에 대해 설명합니다.
Abstract
지카 바이러스(ZIKV)는 플라비바이러스(Flavivirus) 속에 속하는 모기 매개 바이러스입니다. ZIKV 감염은 선천성 뇌 이상 및 성인의 길랭-바레 증후군과 관련이 있습니다. 질병 기전을 이해하기 위한 ZIKV에 대한 연구는 백신 및 치료제 개발을 촉진하는 데 중요합니다. 바이러스를 정량화하는 방법은 바이러스학 분야에서 중요하고 기본적입니다. 초점 형성 분석(FFA)은 항체로 바이러스 항원을 검출하고 과산화효소 면역염색 기술을 사용하여 세포의 감염 병소를 식별하는 바이러스 정량 분석법입니다. 현재 연구에서는 24-well 및 96-well(고처리량) 형식을 모두 사용하는 바이러스 전파 및 정량화 프로토콜을 설명합니다. 다른 유사한 연구와 비교했을 때, 이 프로토콜은 다른 바이러스에 대한 이 분석법의 사용을 확장하기 위한 가이드 역할을 할 수 있는 초점 크기 최적화를 추가로 설명했습니다. 첫째, ZIKV 증식은 Vero 세포에서 3일 동안 수행됩니다. ZIKV를 함유하는 배양 상층액은 FFA를 사용하여 수거하고 정량화합니다. 간단히 말해서, 바이러스 배양을 Vero 세포에 접종하고 2-3일 동안 배양합니다. 그런 다음 병소 형성은 세포 고정, 투과화, 차단, 항체 결합 및 과산화효소 기질을 사용한 배양을 포함한 최적화된 염색 공정 후에 결정됩니다. 염색된 바이러스 병소는 실체 현미경(24-웰 형식의 수동 계수) 또는 소프트웨어 분석기(96-웰 형식의 자동 계수)를 사용하여 시각화됩니다. FFA는 재현 가능하고 비교적 빠른 결과(3-4일)를 제공하며 플라크를 형성하지 않는 바이러스를 포함한 다양한 바이러스에 사용하기에 적합합니다. 결과적으로 이 프로토콜은 ZIKV 감염 연구에 유용하며 다른 임상적으로 중요한 바이러스를 검출하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
지카 바이러스(ZIKV) 감염은 모기 매개 바이러스성 질병으로 부상하고 있습니다. ZIKV의 첫 번째 고립은 1947년 우간다에서 이루어졌다 1,2; 1947년부터 2007년까지는 임상 증상이 가장 흔하게 무증상이고 자기 제한적인 열성 질환을 특징으로 하기 때문에 방치되었습니다. 2007년 지카 바이러스는 얍 제도에서 시작되었고3,4 2013년부터 2014년까지 태평양 지역(프랑스령 폴리네시아, 이스터 섬, 쿡 제도, 뉴칼레도니아)에서 더 큰 전염병이 발생했다 5,6,7,8 성인에서 처음으로 심각한 신경학적 합병증인 길랭-바레 증후군(GBS)이 보고되었다 9. 2015년과 2016년 사이에, 2013년 브라질에서 ZIKV의 아시아 유전자형이 출현한 후 처음으로 광범위한 ZIKV 전염병이 아메리카 대륙을 휩쓸었다10. 이 발병 기간 동안 440,000건에서 130만 건의 소두증 및 기타 신경학적 장애가 신생아에게 보고되었다11. 현재 ZIKV 감염에 대한 특별한 치료법은 없습니다. 따라서 특히 임신 중 감염을 예방할 수 있는 ZIKV 백신에 대한 의학적 필요성이 시급합니다.
바이러스 정량화는 샘플에 존재하는 바이러스의 수를 결정하는 프로세스입니다. 그것은 연구에서 중요한 역할을 하며 학술 실험실에는 의학 및 생명 과학과 같은 많은 분야가 포함됩니다. 이 공정은 바이러스 백신, 재조합 단백질, 바이러스 항원 또는 항바이러스제의 생산과 같은 상업 부문에서도 중요합니다. 바이러스 정량화를 위해 많은 방법 또는 분석법을 사용할 수 있다12. 방법 또는 분석법의 선택은 일반적으로 바이러스 특성, 원하는 정확도 수준, 실험 또는 연구의 특성에 따라 달라집니다. 일반적으로, 바이러스를 정량화하는 방법은 두 가지 범주로 나눌 수 있다: 바이러스 핵산(DNA 또는 RNA)의 존재를 검출하는 분자 분석과 시험관 내에서 바이러스 감염성을 측정하는 분석법 12. 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR, DNA용) 또는 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR, RNA용)13 및 디지털 액적 PCR(14)은 주어진 샘플에서 바이러스 핵산을 정량화하는 데 사용되는 일반적인 분자 기법의 예이다(15). 그러나, 이러한 고감도 분자 기술은 생존 가능한 바이러스와 생존 불가능한 바이러스를 구별할 수 없다15. 따라서 세포에 대한 바이러스 감염성과 같은 생물학적 특징에 대한 정보가 필요한 연구는 위에서 언급한 분자 기술을 사용하여 완료할 수 없습니다. 생존 가능한 바이러스의 존재를 측정하고 결정할 수 있는 분석이 필요합니다. 바이러스 감염도를 측정하는 분석법에는 플라크 형성 분석법(PFA), 50% 조직 배양 감염선량(TCID50), 형광 초점 분석법 및 투과 전자 현미경(TEM)이 포함됩니다12.
1952년 Renato Dulbecco가 개발한 PFA는 ZIKV16을 포함하여 바이러스 적정에 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다. 감염성 용해 바이러스에 대한 바이러스 농도를 직접 측정하는 데 사용됩니다. 이 방법은 바이러스 감염 후 접종된 세포 단층에서 세포병증 효과(CPE, 세포 사멸 영역 또는 플라크, 감염되지 않은 세포로 둘러싸인 감염 영역)를 생성하는 용해 바이러스의 능력을 기반으로 합니다. 그러나 분석에는 유용성에 영향을 미치는 몇 가지 단점이 있습니다. 분석은 시간이 많이 걸리고(바이러스에 따라 약 7-10일 소요), CPE에 의존하며 오류가 발생하기 쉽습니다. 본 연구에서는 24웰 플레이트 및 96웰 플레이트 형식에서 ZIKV를 검출하고 정량화하기 위한 면역 비색 기법인 초점 형성 분석(FFA)을 보고합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
바이러스 역가를 결정하기 위한 몇 가지 분석법이 있습니다. PFA는 FFA와 유사한 바이러스 정량 프로토콜을 가지고 있으며, 바이러스 접종물을 희석하여 개별 플라크 또는 병소를 구별할 수 있습니다. 염색 후, 각 플라크 또는 병소는 접종물(19) 내의 단일 감염 입자를 나타낸다. PFA는 세포 용해 또는 사멸로 인한 플라크 형성을 시각화하기 위해 크리스탈 바이올렛으로 염색됩니다. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 장기 연구 보조금 제도(LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018)와 고등 기관 우수 센터(HICoE) 프로그램(MO002-2019)에 대한 자금 지원에 따라 말레이시아 고등 교육부의 지원을 받았습니다. 초점 형성 분석을 위한 염색 워크플로우를 보여주는 이 연구의 그림 3은 BioRender.com(2022)의 “DAB Immunohistochemistry”에서 채택한 것입니다. https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry 에서 가져옴.
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
Referências
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