Detektion av onormalt prionprotein genom immunhistokemi
Summary
Immunolabeling onormalt prionprotein med hjälp av immunhistokemiska protokoll kräver specifika prov- och anti-PrP-antikroppsberedningsmetoder. Detta protokoll beskriver de viktigaste stegen i epitopdemaskering för att säkerställa korrekt PrP-immunmärkning och för att minimera icke-specifik bakgrundsfärgning. Detta tillvägagångssätt beaktar också biosäkerhetsåtgärder vid genomförande av immunhistokemiska studier med prioninfekterade vävnader.
Abstract
Onormala prionproteiner (PrPSc) är den sjukdomsassocierade isoformen av cellulärt prionprotein och diagnostiska markörer för transmissibel spongiform encefalopati (TSE). Dessa neurodegenerativa sjukdomar drabbar människor och flera djurarter och inkluderar skrapie, zoonotisk bovin spongiform encefalopati (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD) och den nyligen identifierade kamelprionsjukdomen (CPD). Diagnos av TSE bygger på immundetektion av PrPSc genom tillämpning av både immunhistokemi (IHC) och västerländska immunoblotmetoder (WB) på encefalonvävnader, nämligen hjärnstammen (obexnivå). IHC är en allmänt använd metod som använder primära antikroppar (monoklonala eller polyklonala) mot antigener av intresse i celler i en vävnadssektion. Antikropps-antigenbindningen kan visualiseras genom en färgreaktion som förblir lokaliserad i det område av vävnaden eller cellen där antikroppen riktades. Som sådan, i prionsjukdomar, liksom i andra forskningsområden, används immunhistokemiska tekniker inte enbart för diagnostiska ändamål utan också i patogenesstudier. Sådana studier innefattar detektering av PrPSc-mönster och typer från de tidigare beskrivna för att identifiera de nya prionstammarna. Eftersom BSE kan smitta människor rekommenderas att biosäkerhetslaboratorier på nivå 3 (BSL-3) och/eller metoder används för att hantera nötkreatur, mindre idisslare och hjortprover som omfattas av TSE-övervakningen. Dessutom rekommenderas inneslutnings- och prionsärskild utrustning, när så är möjligt, för att begränsa kontaminering. PrPSc IHC-förfarandet består av ett epitoptest av myrsyraepitoper som också fungerar som en prioninaktiveringsåtgärd, eftersom formalinfixerade och paraffininbäddade vävnader som används i denna teknik förblir smittsamma. Vid tolkning av resultaten måste man vara noga med att skilja icke-specifik immunmärkning från målmärkning. För detta ändamål är det viktigt att känna igen artefakter av immunmärkning som erhållits i kända TSE-negativa kontrolldjur för att skilja dem från specifika PrP Sc-immunmärkningstyper, som kan variera mellan TSE-stammar, värdarter och prnp-genotyp, som beskrivs närmare häri.
Introduction
Enligt prionhypotesen är den onormala isoformen (PrPSc) den primära eller enda komponenten i smittämnet vid transmissibel spongiform encefalopati (TSE). Bekräftelse för diagnos av TSE bygger på immunodetektion av PrPSc genom tillämpning av immunhistokemiprotokoll (IHC) och/eller västerländska immunoblotmetoder (WB) av encefalonvävnader1.
IHC är en metod som använder monoklonala eller i vissa fall polyklonala antikroppar (som primära antikroppar) som ett första steg i immunfärgning av specifikt riktade antigener av intresse belägna i celler i en vävnadssektion. Eventuell effektiv primär antikropps-antigenbindning visualiseras sedan med hjälp av sekundära antikroppar specifika för de primära antikropparna. Dessa sekundära antikroppar är konjugerade till enzymer, såsom pepparrotsperoxidas (HRP) eller alkaliskt fosfatas (AP). Visualisering uppnås sedan genom att tillsätta ett substrat till dessa enzymer, vilket ger olösliga färgprodukter lokaliserade i områden där de primära antikropparna är bundna till de riktade antigenerna. Förbättrad visualisering kan uppnås genom motfärgning, där ett färgämne används för att skapa en kontrast mellan immunomärkt och icke-immunmärkt vävnad2.
Med IHC med användning av formalinfixerade paraffininbäddade vävnader (FFPE) kan formalinfixering upphäva effektiviteten hos primära antikroppar på grund av tvärbindning genom formaldehyd och uppvärmning och uttorkning under paraffininbäddning. Dessa förändrar konformationen av proteiner, förstör, denaturerar eller maskerar epitoperna, vilket minskar eller upphäver deras upptäckt3. Som sådan kräver detta antigenhämtning (AR). AR-teknikerna stör formaldehydrelaterad kemisk grupptvärbindning i de antigena molekylerna, vilket återställer eller demaskerar den ursprungliga antigen-proteinkonformationen. Detta resulterar i återvinning av antikropps-antigen (epitop) affinitet för immunmärkning. Den slutliga effekten av AR beror på egenskaperna hos det riktade antigenet och/eller den primära antikroppen2.
Värmeinducerad antigen (epitop) hämtning (HIER) är en procedur av AR3 och används rutinmässigt för PrPSc IHC-detektion, som beskrivs häri. IHC är viktigt för diagnos och används i forskningslaboratorier för att bestämma vävnadsdistributionen av ett patologiassocierat antigen. Det används ofta för att diagnostisera och undersöka cancer, neurovetenskap och infektionssjukdomar4, bland andra. För TSE spelar IHC en viktig roll i diagnos och forskning för att bekräfta och undersöka PrPSc-distribution i naturliga värdar och experimentella modeller. IHC bidrar till prionpatogenesstudier och analys av PrP Sc-deponeringstyper och -mönster, nämligen i neurala vävnader5, för att upptäcka avvikelser från rutinmässigt beskrivna infektioner och identifiera förmodade nya prionstammar.
Eftersom prioner av bovin spongiform encefalopati (BSE) kan infektera människor, kan vissa laboratorieprotokoll som ingår i arbetet med BSE kräva användning av BSL-3-anläggningar och -metoder6. Dessa inkluderar användning av en förseglad sekundär behållare för att transportera potentiella BSE-infekterade vävnadsprover inom institutet och laboratoriet. Det omfattar också att utse inneslutningsområden och särskild prionutrustning för forskning och analys av BSE när så är möjligt. Detta görs för att förhindra kontaminering utanför arbetsområdet och ge ett begränsat utrymme eftersom dekontamineringsförfaranden blir nödvändiga.
Följaktligen följer Laboratory of Pathology of INIAV rekommenderade biosäkerhetsnivå-3 (BSL-3) anläggningar och praxis6 för att hantera potentiella prioninfekterade prover av vävnader från nötkreatur, små idisslare och hjortdjur som är associerade med TSE-övervakningen.
Formalinfixerade och paraffininbäddade vävnader som ingår i TSE-diagnostik eller TSE-forskningsförfaranden, särskilt i centrala nervsystemet, kan vara potentiellt smittsamma. Dessa fasta vävnader måste därför behandlas med myrsyra för att minska infektiviteten hos prioner, om sådana förekommer, före vävnadsbearbetningen. Detta utförs genom att placera fasta, trimmade vävnader (ca 2-4 mm tjocklek) i en bearbetningskassett. Kassetten nedsänks sedan i 98% myrsyra (i 1 h). Efter nedsänkning tvättas kassetterna med vävnader i rinnande kranvatten i 30 minuter och återförs till fixeringsmedlet före vidare bearbetning. Om vävnadssnitt inte behandlas före bearbetning måste postmikrotomiska vävnadssnitt nedsänkas i outspädd myrsyra i minst 5 minuter före histologisk färgning7. IHC-protokollet för PrPSc innehåller ett rutinmässigt myrsyraepitop-demasking steg, som också tjänar till att inaktivera prioner7. Efter dessa prioninaktiveringssteg kan de resulterande fasta vävnaderna bearbetas vid BSL-2 med användning av standard BSL-2-praxis.
Det minsta kravet på vävnadsprovtagning för TSE-diagnos hos alla djur som omfattas av TSE-övervakningen är insamling av hjärnstammen (på obexnivå). För att upptäcka atypisk BSE och skrapie rekommenderas dessutom att en del av lillhjärnan också samlas in 1,8. För CWD-diagnos bör både hjärnstammen (obex) och retrofaryngeala lymfkörtlar testas eftersom PrP Sc kan detekteras i lymfoida vävnader utan detekterbar PrPSc i obex9, granskad av Machado et al.10.
Obex-delen av hjärnstammen inkluderar diagnostiska TSE-målplatser, nämligen dorsal vaguskärna (DVN), enkroppskärna (STN) och ryggradskärnan i trigeminusnerven (V). Dessa områden uppvisar konsekvent bilateral ackumulering av PrPSc , även i de tidiga stadierna av BSE och klassisk skrapie. I kliniska fall av avancerad TSE uppvisar alla gråämnesområden inom hjärnstammen utbredd PrPSc-fördelning 11.
Före snittning och bearbetning utvärderas hjärnproverna (figur 1) för att fastställa graden av autolys och förekomsten av eventuell vävnadsskada som potentiellt äventyrar provets lämplighet för IHC-baserad bekräftande diagnos8. För att validera integriteten hos de preparativa protokollen och analysresultaten ingår TSE-positiva och negativa vävnadsprover som kontroller i samband med beredning av vävnader från testfall i varje analys.
Figur 1: PrPSc IHC-förfarandet. Representation som visar steg-för-steg-sekvensen av PrPSc IHC-proceduren från deparaffinisering av vävnadssnitt till eventuell immunfärgning och detektion (FFPE – Formalinfixerad paraffininbäddad; Mab – monoklonal antikropp; DAB – 3,3′ diaminobensidin). Denna siffra skapades BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Protocol
Representative Results
Discussion
TSE är potentiella zoonotiska sjukdomar. Efter uppkomsten av BSE 1986 i Förenade kungariket blev Portugal en av Europeiska unionens medlemsstater med en högre förekomst av denna sjukdom14,15. För att bekämpa denna sjukdom, andra TSE som har uppstått (klassisk och atypisk skrapie, BSE-varianter och för närvarande övervakning av chronic wasting disease hos hjortdjur), har övervakningsmekanismer utvecklats av generaldirektoratet för livsmedel och veterin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna artikel finansierades av projektet POCI-01-0145-FEDER-029947 “Chronic wasting disease risk assessment in Portugal” med stöd av FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) – FEDER -Balcão2020. Författarna till forskningsenheten CECAV fick också finansiering från FCT, under projektet UIDB/CVT/0772/2020.Vi tackar Bruce C. Campbell, forskningsdirektör (pensionerad), Western Regional Research Center, USDA, för hans hjälp.
Materials
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | Undituled |
| Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water | |||
| Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase |
Vector Laboratories | PK-6100 | Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing. |
| Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections. |
| Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section. |
| DakoCytomation Pascal pressure chamber | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich’s Hematoxylin: | |||
| Hematoxylin | Merck | 115938 | Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use. |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 101830 | |
| Potassium alum | Merck | 1.01047.1000 | |
| Glycerin | Merck | 1.04091.1000 | |
| Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2): | 40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use |
||
| Hydrogen peroxide (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Formic acid 98% | Merck | 1.00264.1000 | Undiluted |
| Microtome | Shandon-AS325 | Microtome | Shandon-AS325 |
| Mounting medium Entellan | Merck | 107960 | Ready- to- use. |
| Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum |
Gibco |
16050-122 |
Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section). |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time. |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10 | Cayman Chemical Company | 189710 | PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11 |
| Shandon CoverplateTM chamber | Thermo Scientific | 72110017 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining center | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack | Thermo Scientific | 73310017 | |
| Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1): | 2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day. |
||
| Tri-sodium citrate dihydrate | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Staining jar and basket | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Superfrost Plus microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6): | 10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day. |
||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Xylene | Panreac Applied Chem ITW reagents | 251769 | Undiluted |
Referências
- . WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. – Scrapie (Version May 2022) Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2022)
- Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M., Oliver, C., Jamur, M. Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 588, 103-119 (2010).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry). Journal Pharmacy Bioallied Sciences. 4, 307-309 (2012).
- Orge, L., et al. Neuropathology of Animal Prion Diseases. Biomolecules. 11 (3), 466 (2021).
- . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020 Available from: https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf (2022)
- APHA. Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo & IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet – International Reference Laboratory for TSE. , (2022).
- Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019)
- TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019)
- Machado, C. N., et al. TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control. Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).
- APHA. Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo & IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet – International Reference Laboratory for TSE. , (2019).
- Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep. The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).
- Simmons, M. M., et al. Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls. Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).
- Orge, L., et al. Identification of H-type BSE in Portugal. Prion. 9 (1), 22-28 (2015).
- Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle. Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).
- Pires, M. A., Travassos, F. S., Gärtner, F. Atlas of veterinary pathology. Biopathology. Lidel VII. 195 (6), 179-180 (2004).
- Pires, M. A., et al. Immunology protocols, didactic series. Applied Sciences. , 357 (2010).
