ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

このプロトコルは、健康なドナー由来のCD34+ HSPCの使用を必要とし、地元の治験審査委員会(IRB)からの倫理的承認と署名されたインフォームドコンセントを必要とします。このプロトコルで使用されたCD34+ HSPCは、正期分娩(妊娠34週>)の臍帯血(UCB)から分離されました。出産前に母親からインフォームドコンセントが得られ、グラーツ医科大学からUCBの収集に関する倫理的承認が得られました(IRB承認:31-322 ex 18/19)。このプロトコルで使用される材料の完全なリストは、 材料表に記載されています。 1. sgRNAの設計と切断効率の評価 目的の突然変異の場所と正しい転写産物をオンラインデータベースツール(COSMIC、https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic など)で検索します。 sgRNA設計ツールを使用して、変異に隣接するsgRNA(エキソンターゲティング)または前のイントロン(イントロンターゲティング)を選択します。このプロトコルでは、ベンチリングのオンラインツールが使用されます。sgRNA設計のための可能なオンラインツールのリストについては、 材料の表 を参照してください。 [DNA 配列> DNA 配列のインポート] > [データベースからインポート] > [+ (作成)] オプションを選択します。目的の遺伝子(例:CALR)を入力し、種としてヒトを選択します > 検索> 正しい転写物(例:CALR-201 -ENST00000316448)を選択し、インポート>。DSブレークを導入する関心領域を選択します(例:イントロン7)。 画面の右側にある [CRISPR ] オプションを選択し、[ ガイドの設計と分析] を選択します。単一のガイドを選択し、 ガイドの長さを20 bpに保ち、SpCas9(NGG)で編集するためのPAMシーケンスを選択します。 オンターゲットスコアが高い(目的の遺伝子座で編集する可能性が高い)とオフターゲットスコアが高い(不要な遺伝子座で編集する可能性が高い)ガイドを選択します。最高のパフォーマンスを発揮するsgRNAを見つけるために、テストするガイドを少なくとも3つ選択してください。sgRNAを化学修飾合成sgRNAとして市販のベンダーに注文してください。注:この段階では、初期スクリーニング用に少量の合成sgRNAを注文することをお勧めします。良好な性能のsgRNAが同定されたら、選択したsgRNAのより大きなオーダーに進みます。 2 x 10 5-5 x 105 CD34+ HSPCを解凍します。 細胞を、1%抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシンなど)を添加した10 mLの予熱したRPMI1640に移します。注:純度>90%のCD34+ HSPCを使用して、最良かつ最も再現性のある結果を得る必要があります。 室温(RT)で350 x g で10分間遠心分離します。血球計算盤で細胞をカウントし、0.2%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)、100 ng / mLトロンボポエチン(TPO)、100 ng / mL幹細胞因子(SCF)、100 ng / mL FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3L)、100 ng / mLインターロイキン-6(IL-6)、35 nM UM171、および0.75 μMステムレゲニン1(SR1)を添加したSFEM II培地に細胞を2.5 x 105 細胞/ mLの濃度に懸濁します。37°C/5%CO2で48時間〜72 時間インキュベートします。注: 今後、完全な培地を HSPC 保持培地と呼びます。 細胞を15 mLチューブに集め、細胞を数えます。トリパンブルー排除により細胞生存率を確認する。開始する前に、トランスフェクションシステムをオンにして、キュベットのオプションを選択します。HSPCに適したプログラムと核放出溶液を選択します(材料表を参照)。2 x 10 5 から5 x 106 の細胞を 1 つの 100 μL キュベットで核形成できます。少数の細胞(例えば、1 x 10 5-2 x 105)を48時間培養して、WTコントロールとして使用する。 RNPコンプレックスを準備します。1.5 mLチューブに、15 μgのCas9と8 μgのsgRNA(モル比1:2.5)を加え、加熱ブロック内で25°Cで10分間インキュベートします。 RNP複合体がインキュベートしている間に、細胞を350 x g のRTで5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を廃棄します。細胞を100 μLの核オフクション溶液に懸濁します。 細胞をRNP複合体と混合し、キュベットに移します。キュベットを軽くたたいて、転送中に形成された可能性のある最終的な気泡を取り除きます。 キュベットをトランスフェクションシステムのホルダーに挿入し、DZ-100プログラムで細胞をエレクトロポレーションします。 エレクトロポレーションの直後に、P/Sを含まない400 μLの予熱したHSPC保持培地を追加します。 細胞数に応じて、適切な培養プレート(24、12、または6ウェルプレート)を使用して、P/Sなしで事前に温めたHSPC保持培地を含む培養プレートに細胞を移します。 プレートを37°C/5%CO2でインキュベーターに移します。核細胞を6〜8時間インキュベートします。 6〜8時間後、古い培地を取り出し、P / Sを添加した新鮮な予熱したHSPC保持培地と交換します。 細胞を2.5 x 10 5から5 x 105の濃度で懸濁し、細胞培養プレート(24、12、または6ウェルプレート)に移します。細胞を37°C/5%CO2で48時間インキュベートします。 2 x 10 5細胞を回収し、350 x gでRTで5分間遠心分離します。開始する前に、加熱ブロックを65°Cと98°Cに設定してください。 上清を廃棄し、1.5 mLチューブ中の1 mLの1x DPBSに細胞を懸濁します。350 x g でRTで5分間遠心分離します。 上清を捨て、細胞を50 μLのDNA抽出溶液に懸濁します。15秒間渦。 65°Cで6分間インキュベートします。 15秒間ボルテックスし、98°Cで2分間インキュベートします。 DSBを中心にして約400〜600bpのアンプリコンを生成するプライマーを用いてPCRによりDSBの領域を増幅する。PCR反応には、0.5〜1 μLの抽出DNAを使用します。注:DNA抽出溶液の組成により、分光光度法ではDNA濃度を正確に定量することはできません。 DNAラダーを使用してPCR産物を1.5%アガロースゲル上で100 Vで45〜60分間実行します。ゲルを青色光またはUVトランスイルミネーターに置きます。 製造元の指示に従って市販のキットを使用して、ゲルから正しいサイズのDNAバンドを抽出します( 材料表を参照)。 PCRからのフォワードプライマーまたはリバースプライマーを使用したサンガーシーケンシングによりサンプルをシーケンスします。長さが400〜600 bpのPCR産物の場合、総容量15 μLで5 ng/mLの濃度でシーケンシングするには、75 ngのDNAが必要です。 sgRNAによって生成される挿入と欠失を特定することによって編集効率を計算するように設計されたプログラムにシーケンスファイルをアップロードすることにより、sgRNAの編集効率を分析します。最もパフォーマンスの高いsgRNAを選択して続行します。注意: 専用のオンラインツールは 、材料の表に記載されています。この解析には、トランスフェクトされたHSPC、WT HSPCの.ab1ファイル、sgRNA配列、およびPAM配列が必要です。 2. 相同性指向修復(HDR)ベクトル構築 HDRテンプレートのデザイン注:WTシーケンスのテンプレートと変異シーケンスのテンプレートの2つのHDRテンプレートを設計する必要があります。目的の遺伝子のゲノム配列とコード配列(CDS)を分子クローニング用の適切なソフトウェアにインポートします(専用ツールは 材料表に記載されています)。ゲノム配列ファイルから、理想的にはDSBの5’末端で400 bpを選択して、左相同性アーム(HA)を設計します。このシーケンスを新しいファイルに貼り付けます。 イントロンがsgRNAで標的化されている場合、スプライスアクセプター(SA)配列を含める必要があります。ターゲットイントロンの最後の150 bpを選択し、左側のHAの後に貼り付けます。エクソンが直接標的化されている場合、この配列は必要ありません(図3)。 CDS ファイルから目的の cDNA を選択します。エキソン配列が標的となる場合は、cDNAがDSB部位のすぐ下流から始まり、目的の遺伝子の以下のすべてのエクソンと終止コドンが含まれていることを確認してください。イントロンを標的とする場合は、cDNAが次のエクソンの最初のコドンから始まることを確認してください。cDNAをコドン最適化し、SA配列の後に挿入します。この目的のために専用のオンラインツールを使用してください(資料表)。 目的のcDNA(SV40またはbGHなど)の後に3’ポリアデニル化(PolyA)シグナルを挿入します(表1)。PolyAに続いて、蛍光タンパク質のプロモーター配列(例えば、脾臓焦点形成ウイルス[SFFV]またはポリユビキチンC[UBC]、 表1)を挿入する。 蛍光タンパク質の配列(すなわち、GFP、BFP、またはmCherryのいずれか)を挿入します。2 つ目の異なる PolyA 信号を挿入します。注:異なるPolyA配列を挿入することで、プラスミドの細菌組換えなどの問題や、テンプレート内の2つの同一の配列による配列アラインメントの問題を回避できます。 ゲノム配列ファイルから、理想的にはDSBの3’末端で400 bpを選択して、適切なHAを設計します。このシーケンスを 2 番目の PolyA の後に挿入します。 テンプレート全体のコピーを作成し、目的の突然変異の配列が含まれるように目的のcDNAを変更します。 蛍光タンパク質を別の蛍光タンパク質と交換する。たとえば、GFPがWTテンプレートに使用された場合、変異テンプレートのBFPまたはmCherryと交換します。HDRテンプレートを構築し、pAAV-MCSプラスミド(または他の適切なバックボーン)にクローニングします。注:アセンブリに必要なフラグメントは、PCRまたは商業的に注文して製造でき、隣接するフラグメントと重複する配列を含む必要があります。目的の変異が点突然変異、小さな挿入、または小さな欠失である場合、WT cDNAを含むHDRテンプレート上で部位特異的突然変異誘発を行うことにより、変異したcDNAをPCRによって作製することができる。 コンピテント 大腸菌 をヒートショック法を使用して組み立てられた製品で変換します。始める前に、バクテリアを氷の上に10分間置きます。 組み立てた製品2 μLを50 μLのバクテリアに加えます。軽くフリックして内容物を混ぜます。 サンプルを氷上に30分間置きます。サンプルを42°Cに設定したサーモブロックに30秒間移します。 サンプルを氷上で5分間移します。室温のSOC培地450 μLを加え、サンプルを37°Cで1時間インキュベートします。 サンプルをアンピシリンを含むLB寒天プレートに広げます。各サンプルについて、細菌溶液の3つの異なる希釈液(未希釈、1:5、および1:10)を100 μL広げて、ピック可能な単一コロニーを有するLB寒天プレートを得た。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。 翌日、サンプルごとに3つのコロニーを選びます。アンピシリンを添加した4 mLのLB培地を含むキャップ付きの15 mLチューブにコロニーを移し、37°Cのシェーカーで一晩インキュベートします。 各コロニーから500 μLの細菌溶液を分注し、後で使用するために冷蔵庫に保管します。ミニプレップを実行して、製造元の指示に従ってプラスミドDNAを抽出します。 サンガーシーケンシング用のサンプルを送信して、プラスミドの正しいアセンブリを確認します。プラスミド全体に分散した十分なプライマーを使用して、配列の確認が中断されないようにし、理想的には各領域を順リードと逆リードで2回カバーします。 正しく組み立てられたプラスミドを含む細菌溶液200 μLを、アンピシリンを添加した200 mLのLB培地に加え、シェーカーで37°Cで一晩インキュベートします。 ミディプレップまたはマキシプレップを実行して、製造元の指示に従ってプラスミドDNAを抽出します。プラスミドDNAを-20°Cで保存します。 組換えAAV6調製注:2つの別々のAAV6準備を実行する必要があります:1つはWT HDRテンプレートを使用したrAAV6用、もう1つは変異したHDRテンプレートを使用したrAAV6用です。このセクションでは、1 つのウイルスのみを準備するために必要な手順について説明します。HEK293T細胞を解凍し、10S、1%P/S、および25 mM HEPESを添加した10 mLの予熱DMEMに細胞を移し、350 x g でRTで5分間遠心分離します。 細胞を1 x 105 細胞/mLの濃度で懸濁し、適切なフラスコ(例えば、175 cm2 フラスコ)に移します。フラスコを37°C/5%CO2のインキュベーターに移します。注:HEK293T細胞は、細胞が完全に回復し、十分な数の細胞を得るために、事前に解凍する必要があります(1つのウイルスの産生には11 x 107 細胞が必要です)。最低3継代後にセルを使用し、細胞を20継代未満に保つことをお勧めします。HEK293T細胞は週に3回分割する必要があります。細胞を維持しながら、これらは70%〜80%のコンフルエントを超えてはなりません。AAV製剤に使用されるDMEMには、L-グルタミンとピルビン酸ナトリウムがすでに補給されているはずです。 細胞を50 mLチューブに回収し、350 x g でRTで5分間遠心分離します。 10S、1%P / S、および25 mM HEPESを添加した20 mLのDMEMに細胞を懸濁し、血球計算盤でカウントします。死細胞排除にはトリパンブルーを使用してください。 175 cm2フラスコに10S、1%P/S、および25 mM HEPESを添加した20 mLのDMEMに3 x 106細胞を播種します。1つのウイルスを生産するために、少なくとも4つの175 cm2フラスコを準備します。細胞を37°C/5%CO2で3日間インキュベートします。注:この手順は、週末にセルを拡張できるため、金曜日に実行するのが最適です。 HEK293T細胞を収穫して数えます。 ウイルスの1つを調製するために、10S、1%P / S、および25 mM HEPESを添加した20 mLのDMEM中に11 x 106 HEK293Tを含む150 mmディッシュをそれぞれ10個準備します。 皿を37°C / 5%CO2 のインキュベーターに24時間入れます。古い培地を慎重に廃棄し、10S、25 mM HEPES、および1 mM酪酸ナトリウムを添加した20 mLの抗生物質を含まないDMEMと交換します。先に進む前に、細胞のコンフルエントが80%を超えていないことを確認してください。 トランスフェクションミックスを入れる15 mLチューブを2本用意します。チューブ1に、5 mLの還元血清培地、60 μgのrAAV6変異HDRプラスミド、および220 μgのpDGM6(ヘルパープラスミド)を加えます。チューブ2に、5 mLの還元血清培地と1120 μLの1 mg/mLポリエチレンイミン溶液(PEI、トランスフェクション試薬)を加えます。 チューブ2の内容物をチューブ1に追加し、30秒間渦巻きます。RTで15分間インキュベートして、DNAをPEIミセルに適切にカプセル化します。注意: 溶液を20分以上保管しないでください。 各皿に1.1 mLの溶液を慎重に滴下し、穏やかに回転させて分配します。皿を37°C / 5%CO2 のインキュベーターに48時間入れます。 48時間後、各皿に250 μLの0.5 M EDTAを加え、皿をインキュベーターに10分間入れます。細胞を皿から洗い流して回収し、500 mL遠沈管または複数の50 mLチューブに移します。 2,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上澄み液を捨てる。上清を完全に除去するには、2,000 x g で4°Cで1分間遠心分離します。 残っている上清を捨てます。上清が残っていると、ウイルスの精製が損なわれる可能性があります。 ボルテックスによってペレットを緩め、製造元の指示に従ってAAV精製キット( 材料の表を参照)を使用してウイルスを抽出します。あるいは、ヨージキサノール勾配超遠心30、31による抽出を行う。 精製したウイルスを分注し、-80°Cで保存します。 最適な形質導入条件を決定するために、AAVを機能的に滴定するか、デジタルドロップレットPCR(ddPCR)32によってAAV力価を定量します。 rAAV6 WT HDRプラスミドの調製のためにこのプロセスを繰り返します。 ddPCRによるAAV滴定開始する前に、加熱ブロックを65°Cと98°Cに設定してください。 5 μLのウイルスに15 μLのDNA抽出溶液を加えてウイルスDNAを抽出します。15秒間渦。 65°Cで6分間インキュベートします。 15秒間渦。98°Cで2分間インキュベートします。 抽出したDNA(ウイルスDNAの1:4希釈)を使用して、ddPCR用のヌクレアーゼフリー(nf)H2Oによる段階希釈(1:400、1:40,000、1:160,000、1:640,000)を調製します。注:ddPCRがすぐに実行されない場合は、希釈液を-20°Cで保存できます。 ddPCR用の希釈液を3つ選択します。使用する希釈液の選択は、ウイルスの濃度によって異なります。好ましくは、3つの異なる希釈液(例えば、1:40,000、1:160,000、および1:640,000)を使用して、機械の検出限界内にある最良の希釈物を見つける。 作業中は試薬を氷上に保管してください。マスターミックスを準備します(すべてのサンプルが重複して測定されます)。各反応について、プローブ用 ddPCR スーパーミックス 12.5 μL、dUTP なし、プライムタイム Std qPCR アッセイ 1.25 μL、AAV-ITR ( 材料表参照)、および 6.25 μL nf-H2O を準備します。 5 μLのDNAを20 μLのマスターミックスと混合します。1:40,000、1:160,000、および1:640,000の希釈に対してこれを実行します。 カートリッジをカートリッジホルダーに入れます。70 μLの液滴生成オイルをオイル建ての列のプローブに追加します。気泡が発生しないように注意してください。 サンプル単位の行に20 μLのサンプル量を追加します。気泡が発生しないように注意してください。 カートリッジをガスケットで密封し、液滴発生器に入れます。マシンのスタートボタンを押して液滴を生成し、ガスケットを取り外し、マルチチャンネルピペットで生成された液滴の40 μLを96ウェルプレートに慎重に移します。液滴や気泡の破壊を避けるためにゆっくりと作業してください。 PCRプレートシーラーを使用して、96ウェルプレートをピアスフォイル(赤い縞模様を上向き)で密封します。プレートをサーモサイクラーに入れます。 容量を40 μL、蓋の温度を105°C、ランプレートを2 °C/sに設定します。 表 2 の説明に従って PCR プログラムを実行します。 使用の30分前に液滴リーダーの電源を入れてください。デスクトップでソフトウェアを開きます。 プレートレイアウトを入力し、[実験]タブで [ABS ]を選択し、[スーパーミックス]タブで ddPCRスーパーミックス を選択します。次に、最初に PRIMEを押してから、ソフトウェアの [システムのフラッシュ ]をクリックしてシステムを開始します。 プレートをリーダーに入れます。実行を開始し、終了したら、データを CSV ファイルとしてエクスポートし、後でスプレッドシートとして分析します。注:ソフトウェアによって生成される数値は、μLあたりのゲノムコピー(GC)です。これらに希釈係数を掛ける必要があります:GC/μL x 5(マスターミックス中のDNAの希釈)x初期希釈(すなわち、40,000または160,000)。 図3:CRISPR/Cas9 HDRノックイン中のイントロニックおよびエキソンターゲティングの概略図。 CRISPR/Cas9 HDRノックインのイントロニックターゲティング戦略とエキソンターゲティング戦略の概略比較。(A)イントロニックターゲティング中に、DNAのイントロンに二本鎖切断が導入される。HDRテンプレートは、LHA、cDNA配列、およびRHAで構成されています。イントロニックターゲティングには、さらに、3’スプライス部位、分岐点、およびポリピリミジントラクトを含むスライスアクセプターの存在が必要です。これにより、正しいスプライシングが可能になります。緑色の点線のボックスは、SA配列に対応する領域を表す。SAのサイズは150bpである。 (B)エキソンターゲティングは、エクソンに直接二本鎖切断を生成することに依存している。HDRテンプレートは、LHA、cDNA配列、およびRHAで構成されています。オレンジ色の点線のボックスは、LHAおよびRHAに対応する領域を示します。HA の理想的なサイズは、それぞれ 400 bp です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 プロモーター 名前 長さ 形容 ティッカー 492 bp 脾臓焦点形成ウイルスプロモーター。強力な哺乳類プロモーター。構成的に表現 ティッカー 400 bp ヒトユビキチンC遺伝子由来のプロモーター。構成的に表現された。 ティッカー 508 bp サイトメガロウイルス由来のプロモーター。エンハンサー領域を含んでいてもよい。構成的に表現された。強力な哺乳類プロモーター。沈黙させることができます。 EF-1a 1182 bp ヒト真核生物の翻訳伸長因子1アルファプロモーター。構成的に表現された。強力な哺乳類プロモーター。 ティッカー 200-300 BP EF-1アルファイントロンレスショートフォーム ティッカー 584 bp CMV早期エンハンサー(C)、ニワトリベータアクチンプロモーター(A)、およびウサギベータグロビン遺伝子のスプライシングアクセプター(G)を含むハイブリッド哺乳動物プロモーター。構成的に表現された。 ポリアデニル化(PolyA)シグナル 略称 長さ 形容 SV40ポリア 82-122 BP サルウイルス40ポリアデニル化シグナル bGH ポリア 224 bp ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル rbGlob PolyA 56 bp ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル 表1:プロモーターおよびポリアデニル化シグナル。 歩 温度 時間 サイクル 酵素活性化 95°C 10分 1倍速 変性 94°C 30秒 42倍速 アニーリング 60°C 1 分 延長 72°C 30秒 酵素の失活 98°C 10分 1倍速 持つ 4°C ∞ 表2:デジタル液滴PCRプログラム。 3. HSPCの編集 HSPCのトランスフェクションおよび形質導入CD34+ HSPCを解凍し、細胞を1%P/Sを添加した10 mLの予熱RPMIに移します。 遠心分離機、350 x g 、室温で10分間。 細胞をHSPC保持培地に2.5 x 10 5細胞/mLの濃度まで懸濁し、37°C/5 %CO2で48時間から72 時間インキュベートします。 細胞を15 mLチューブで回収します。細胞をカウントし、トリパンブルー排除により細胞生存率を確認する。2 x 10 5と5 x 106 細胞の間で、単一のキュベット内で核形成することができます。計算したセル数に応じて適切な数のキュベットを用意します。 RNPコンプレックスを準備します。1.5 mLチューブに、15 μgのCas9と8 μgのsgRNA(モル比1:2.5)を加え、加熱ブロック内で25°Cで10分間インキュベートします。 RNP複合体がインキュベートされている間に、細胞を350 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。 細胞を100 μLの核オフクション溶液に懸濁します。細胞をRNP複合体と混合し、キュベットに移します。 キュベットを軽くたたいて、移動中に形成された可能性のある残留気泡を取り除きます。 キュベットをトランスフェクションシステムのホルダーに挿入し、sgRNA設計のセクションで前述したように細胞をエレクトロポレーションします。 エレクトロポレーションの直後に、P/Sを含まない400 μLの予温めたHSPC保持培地を加え、P/Sを含まない500 μLの予め加温したHSPC保持培地を含む組織培養プレートに微細トランスファーピペットで細胞を移します。 細胞数に応じて、適切な培養プレート(24、12、または6ウェルプレート)を使用して、0.25 x 10 6から1 x 106細胞/mLの間の密度に到達します。プレートを37°C/5%CO2でインキュベーターに移します。 凍結したrAAVを含むバイアルを氷上で解凍します。各rAAV6の最適量を細胞懸濁液にピペッティングすることによって細胞を形質導入する。エレクトロポレーション後20〜30分以内に形質導入を行い、高い形質導入効率を実現します。注:各ウイルスの最適濃度(WT HDRテンプレート用の1つのウイルスと変異したHDRテンプレート用の別のウイルス)は実験的に決定する必要があります。通常、5,000〜10,000 GC /細胞(例えば、1 x 106細胞に対して5 x 109 GC)は高い形質導入をもたらす。 細胞懸濁液をピペットで穏やかに混合します。形質導入した細胞を37°C/5%CO2で6〜8時間インキュベートします。6〜8時間後、細胞をチューブに集め、RTで350 x g で5分間遠心分離します。 古い培地を廃棄し、P/Sを添加した新しい予熱したHSPC保持培地と交換します。 細胞を2.5 x 10 5-5 x10 5細胞/mLの濃度で懸濁し、組織処理した細胞培養プレート(24、12、または6ウェルプレート)に移します。ソーティングに進む前に、細胞を37°C/5%CO2で48時間インキュベートします。 ヘテロ接合型GOF変異を有する改変HSPCのフローソーティング細胞を15 mLチューブで回収し、350 x g でRTで5分間遠心分離します。上清を除去し、0.1% BSAを含む1 mLのDPBSに細胞を懸濁し、350 x g でRTで5分間遠心分離します。 上清を廃棄し、細胞数に応じてDPBS+0.1%BSAの適量で細胞を懸濁する。注:ソーターを詰まらせるリスクを減らすために、細胞を最小容量200 μLで懸濁し、1 x 107 細胞/ mLを超えないようにすることをお勧めします。 細胞をキャップ付きの滅菌FACSチューブに移します。7-AADまたはその他の生存率色素(蛍光タンパク質との適合性に応じて)を細胞懸濁液に追加して、生細胞/死細胞を排除します。 蛍光レポータータンパク質に対して二重陽性の生細胞を、200 μLのHSPC保持培地を含む収集チューブに選別します。注:選別手順中に適切なゲーティングを確保するために、AAVのみで形質導入された細胞で構成される適切なコントロールを追加する必要があります。 選別した細胞をRTで350 x g で5分間遠心分離し、細胞をHSPC保持培地に2.5 x 105 細胞/mLの濃度で懸濁して培養液でさらに増殖させるか、細胞を直接機能アッセイに使用します。 4. 遺伝子編集成功の確認 ゲノムDNA抽出開始する前に、加熱ブロックを65°Cと98°Cに設定してください。 2 x 10 5ゲノム編集およびソート精製された細胞を回収し、350 x gで5分間遠心分離します。 前述のようにgDNAを抽出します。DNA溶液をPCRに直接使用するか、-20°Cで保存してください。 インアウトPCR5’挿入部位を増幅するために2つのプライマーを設計します(図4A):プライマーフォワード1は、左相同性アームの外側のゲノム遺伝子座を標的にします。プライマーリバース2は、組込み配列を標的とする。 インアウトPCRでは、反応ごとに以下のPCRミックスを準備します。10 μL の PCR マスターミックス (2x; 材料表を参照)1 μL プライマーフォワード 1 (10 μM ストック)1 μL プライマーリバース 2 (10 μM ストック)0.5-1.0 μLの抽出されたDNAヌクレアーゼフリーのH2Oを最終容量20 μLまで注:複数の反応の場合は、ピペッティングエラーを考慮して、1つの追加の反応を含むマスターミックスを準備することをお勧めします。非テンプレートコントロールとモック処理サンプルからのテンプレートDNAを含めることが重要です。 適切なサーマルサイクリングプログラムを使用してPCR反応を実行します(製造元の指示を参照)。注:最初にプライマーペアをテストして、最適なアニーリング温度を得ることをお勧めします。これは、Tmを計算し、次に温度勾配を実行できるサーモサイクラーでPCRを実行することによって行うことができます。 DNAラダーを使用してPCR産物を1.5%アガロースゲル上で100 Vで45〜60分間実行します(図4B)。ゲルを青色光またはUVトランスイルミネーターに置きます。ゲルからバンドを切り取ります。 DNAゲル抽出キットを使用してバンドからDNAを抽出します。抽出したPCRサンプルをサンガーシーケンシング用の適切なプライマーとともに送信し、内因性遺伝子座での目的のcDNAの正確かつシームレスな統合を確認します。 図4:インアウトPCRによるゲノム統合の検証 。 (A)インアウトPCR戦略の概略図。描かれた戦略では、2つのプライマーが設計されました。プライマーフォワード1はLHA外のゲノム遺伝子座を標的とし、プライマーリバース2はコドン最適化配列を標的とする。(B)アガロースゲル電気泳動の模式図。正常に編集された細胞(RNP + AAV)のみがインアウトPCR中にPCR産物を生成しますが、編集されていないサンプル(AAVのみ)はPCR産物を生成しません。省略形: NTC = 非テンプレート制御。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。