Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas

Este protocolo requiere el uso de HSPC CD34+ derivadas de donantes sanos y requiere la aprobación ética de las juntas locales de revisión institucional (IRB) y el consentimiento informado firmado. Las HSPC CD34+ utilizadas en este protocolo se aislaron de la sangre del cordón umbilical (UCB) de partos a término (>34 semanas de gestación). Se obtuvo el consentimiento informado de las madres antes del parto, y se obtuvo la aprobación ética para la recolección de UCB (aprobación IRB: 31-322 ex 18/19) de la Universidad Médica de Graz. Una lista completa de los materiales utilizados en este protocolo se puede encontrar en la Tabla de materiales. 1. Diseño de sgRNA y evaluación de eficiencias de corte Busque la ubicación de la mutación deseada y la transcripción correcta en una herramienta de base de datos en línea (por ejemplo, COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). Seleccione un sgRNA adyacente a la mutación (orientación exónica) o en el intrón anterior (orientación intrónica) mediante una herramienta de diseño de sgRNA. En este protocolo, se utiliza la herramienta en línea de Benchling. Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de posibles herramientas en línea para el diseño de sgRNA. Seleccione la opción + (crear) > Secuencia de ADN > Importar secuencias de ADN > Importar desde bases de datos. Ingrese el gen deseado, por ejemplo, CALR y seleccione humano como la especie > Buscar > Seleccione la transcripción correcta (por ejemplo, CALR-201 -ENST00000316448) > Importar. Seleccione la región de interés en la que desea introducir la pausa DS (por ejemplo, intrón 7). Seleccione la opción CRISPR en el lado derecho de la pantalla y seleccione Diseñar y analizar guías. Seleccione una sola guía, mantenga la longitud de la guía en 20 pb y la secuencia PAM para editar con SpCas9 (NGG). Elija una guía con una puntuación alta en el objetivo (alta probabilidad de editar en el lugar deseado) y una puntuación alta fuera del objetivo (baja probabilidad de editar en loci no deseados). Elija al menos tres guías para probar con el fin de encontrar el sgRNA de mejor rendimiento. Solicite el sgRNA como un sgRNA sintético modificado químicamente a un proveedor comercial.NOTA: Es aconsejable en esta etapa ordenar una pequeña cantidad de sgRNAs sintéticos para la detección inicial. Una vez que se haya identificado un sgRNA de buen rendimiento, proceda con un orden mayor del sgRNA seleccionado. Descongelar 2 x 10 5-5 x 105 CD34+ HSPCs. Transfiera las células a 10 ml de RPMI1640 precalentado suplementado con antibióticos al 1% (por ejemplo, penicilina/estreptomicina).NOTA: Los HSPC CD34 + con una pureza >90% deben usarse para lograr los mejores y más reproducibles resultados. Centrifugadora a 350 x g a temperatura ambiente (RT) durante 10 min. Contar las células con un hemocitómetro y suspender las células en medio SFEM II suplementado con 0,2% de penicilina/estreptomicina (P/S), 100 ng/ml de trombopoyetina (TPO), factor de células madre (SCF) de 100 ng/ml, ligando 3 tirosina quinasa 3 similar a FMS/ml (FLT3L), 100 ng/ml de interleucina-6 (IL-6), 35 nM UM171 y 0,75 μM StemRegenin1 (SR1) hasta una concentración de 2,5 x 105 células/ml. Incubar a 37 °C/5% de CO2 durante 48 h -72 h.NOTA: El medio completo se denominará a partir de ahora medio de retención HSPC. Recoja las células en un tubo de 15 ml y cuente las células. Compruebe la viabilidad celular mediante la exclusión de azul de tripano.Antes de comenzar, encienda el sistema de transfección y seleccione la opción para las cubetas. Seleccione el programa y la solución de nucleofección apropiados para las HSPC (consulte la Tabla de materiales). Entre 2 x 10 5 y5 x 106 células pueden ser nucleofecadas en una cubeta de 100 μL. Reservar un pequeño número de células (por ejemplo, 1 x 10 5-2 x 105) para mantenerlas en cultivo durante 48 h para usarlas como control WT. Preparar el complejo RNP. En un tubo de 1,5 ml, añadir 15 μg de Cas9 y 8 μg de sgRNA (relación molar 1:2,5) e incubar a 25 °C durante 10 min en un bloque de calentamiento. Mientras el complejo RNP se está incubando, centrifugar las células a 350 x g a RT durante 5 min y desechar el sobrenadante usando una pipeta. Suspender las células en 100 μL de solución de nucleofección. Mezclar las células con el complejo RNP y transferir a la cubeta. Golpee suavemente la cubeta para eliminar cualquier burbuja de aire eventual que pueda haberse formado durante la transferencia. Inserte la cubeta en el soporte del sistema de transfección y electropolara las células con el programa DZ-100. Inmediatamente después de la electroporación, añadir 400 μL de medio de retención HSPC precalentado sin P/S. Transfiera las células con una pipeta de transferencia fina a una placa de cultivo que contenga medio de retención de HSPC precalentado sin P/S. Dependiendo del número de células, utilice una placa de cultivo adecuada (placa de 24, 12 o 6 pocillos) para alcanzar una densidad entre 0,25 x 10 6 y 1 x 106 células/ml. Transfiera la placa a la incubadora a 37 °C/5% deCO2. Incubar las células nucleofecadas durante 6-8 h. Después de 6-8 h, retire el medio viejo y reemplácelo con un medio de retención de HSPC fresco precalentado complementado con P/S. Suspender las células a una concentración entre 2,5 x 10 5 y 5 x 105 y transferirlas a una placa de cultivo celular (placa de 24, 12 o 6 pocillos). Incubar las células durante 48 h a 37°C/5% deCO2. Cosechar 2 x 10 5 células y centrifugar a 350 x g a RT durante5 min. Antes de empezar, ajuste los bloques calefactores a 65 °C y 98 °C. Deseche el sobrenadante y suspenda las células en 1 ml de 1x DPBS en un tubo de 1,5 ml. Centrífuga a 350 x g a RT durante 5 min. Deseche el sobrenadante y suspenda las células en 50 μL de solución de extracción de ADN. Vórtice durante 15 s. Incubar durante 6 min a 65 °C. Vórtice durante 15 s e incubar durante 2 min a 98 °C. Amplificar la región del DSB mediante PCR utilizando cebadores que generan un amplicón de unos 400-600 pb con el DSB en el centro. Utilice 0,5-1 μL de ADN extraído para la reacción de PCR.NOTA: Debido a la composición de la solución de extracción de ADN, las concentraciones de ADN no se pueden cuantificar con precisión mediante espectrofotometría. Ejecute el producto de PCR con una escalera de ADN en un gel de agarosa al 1,5 % a 100 V durante 45-60 min. Coloque el gel sobre un transiluminador de luz azul o UV. Extraiga la banda de ADN del tamaño correcto del gel utilizando un kit disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Secuenciar las muestras mediante secuenciación de Sanger utilizando el cebador directo o inverso de la PCR. Para productos de PCR de 400-600 pb de longitud, se requieren 75 ng de ADN para la secuenciación con una concentración de 5 ng/ml en un volumen total de 15 μL. Analizar la eficiencia de edición de los sgRNAs cargando los archivos de secuenciación en un programa diseñado para calcular la eficiencia de edición mediante la identificación de la inserción y deleciones producidas por el sgRNA. Seleccione el sgRNA de mejor rendimiento con el que desea continuar.NOTA: Las herramientas en línea dedicadas se enumeran en la Tabla de materiales. Este análisis requiere los archivos .ab1 de las HSPC transfectadas y WT, la secuencia sgRNA y la secuencia PAM. 2. Construcción vectorial de reparación dirigida por homología (HDR) Diseño de plantilla HDRNOTA: Se deben diseñar dos plantillas HDR: una plantilla para la secuencia WT y una plantilla para la secuencia mutada.Importe la secuencia genómica y la secuencia codificante (CDS) del gen deseado en un software apropiado para la clonación molecular (se pueden encontrar herramientas dedicadas enumeradas en la Tabla de materiales). A partir del archivo de secuencia genómica, diseñe el brazo de homología izquierda (HA) seleccionando idealmente 400 pb en el extremo 5′ del DSB. Pegue esta secuencia en un archivo nuevo. Si un intrón está dirigido con el sgRNA, se debe incluir una secuencia aceptora de empalme (SA). Seleccione los últimos 150 pb del intrón de destino y péguelo después del HA izquierdo. Si el exón está dirigido directamente, esta secuencia no es necesaria (Figura 3). En el archivo CDS, seleccione el ADNc que le interese. En caso de que se dirija a una secuencia exónica, asegúrese de que el ADNc comience inmediatamente aguas abajo del sitio DSB e incluya todos los siguientes exones del gen de interés, así como el codón de parada. En caso de que se dirija un intrón, asegúrese de que el ADNc comience con el primer codón del siguiente exón. Codón-optimizar el ADNc e insertarlo después de la secuencia SA. Utilice herramientas en línea dedicadas para este propósito (Tabla de materiales). Inserte una señal de poliadenilación 3′ (PolyA) después del ADNc de interés (por ejemplo, SV40 o bGH) (Tabla 1). Después de la PolyA, inserte una secuencia promotora (por ejemplo, virus formador de foco de bazo [SFFV] o poliubiquitina C [UBC], Tabla 1) para la proteína fluorescente. Inserte la secuencia para la proteína fluorescente (es decir, GFP, BFP o mCherry). Inserte una segunda señal PolyA diferente pero diferente.NOTA: La inserción de una secuencia PolyA diferente evitará problemas como la recombinación bacteriana del plásmido o problemas con la alineación de secuencias debido a dos secuencias idénticas en la plantilla. A partir del archivo de secuencia genómica, diseñe el HA correcto seleccionando idealmente 400 pb en el extremo 3′ del DSB. Inserte esta secuencia después del segundo PolyA. Cree una copia de toda la plantilla y modifique el ADNc de interés para que contenga la secuencia de la mutación deseada. Intercambie la proteína fluorescente con una proteína fluorescente diferente. Por ejemplo, si se usó GFP para la plantilla WT, cámbiela con BFP o mCherry por la plantilla mutante. Construya y clone las plantillas HDR en el plásmido pAAV-MCS (u otra columna vertebral adecuada).NOTA: Los fragmentos requeridos para el ensamblaje pueden ser producidos por PCR u ordenados comercialmente y necesitan contener secuencias superpuestas con sus fragmentos vecinos. Si la mutación de interés es una mutación puntual, una inserción pequeña o una pequeña deleción, el ADNc mutado se puede producir mediante PCR realizando una mutagénesis dirigida al sitio en la plantilla HDR que contiene el ADNc WT. Transforme la competente Escherichia coli con el producto ensamblado utilizando el método de choque térmico. Antes de comenzar, coloque las bacterias para descongelar en hielo durante 10 minutos. Añadir 2 μL de los productos ensamblados a 50 μL de bacterias. Mezcle el contenido moviendo suavemente. Coloque las muestras en hielo durante 30 minutos. Transfiera las muestras a un termobloque ajustado a 42 °C durante 30 s. Transfiera las muestras en hielo durante 5 minutos. Añadir 450 μL de medio SOC a temperatura ambiente e incubar las muestras a 37 °C durante 1 h. Extienda las muestras en placas de agar LB que contengan ampicilina. Para cada muestra, extienda 100 μL de tres diluciones diferentes de la solución bacteriana (sin diluir, 1:5 y 1:10) para obtener placas de agar LB con colonias individuales que se puedan recoger. Incubar las placas durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, elija tres colonias por muestra. Transfiera las colonias a tubos de 15 ml con tapas que contengan 4 ml de medio LB suplementado con ampicilina e incubar durante la noche en un agitador a 37 °C. Alícuota 500 μL de la solución bacteriana de cada colonia y guárdela en la nevera para su uso posterior. Realice una mini preparación para extraer ADN plásmido según las instrucciones del fabricante. Enviar las muestras para la secuenciación de Sanger para confirmar el correcto ensamblaje de los plásmidos. Utilice suficientes cebadores distribuidos por todo el plásmido para garantizar la confirmación ininterrumpida de la secuencia, idealmente cubriendo cada región dos veces con lecturas hacia adelante y hacia atrás. Añadir 200 μL de la solución bacteriana que contiene el plásmido correctamente ensamblado a 200 ml de medio LB suplementado con ampicilina e incubar en un agitador durante la noche a 37 °C. Realice una preparación midi o maxi-para extraer el ADN plásmido según las instrucciones del fabricante. Conservar el ADN plásmido a -20 °C. Preparación AAV6 recombinanteNOTA: Será necesario realizar dos preparaciones AAV6 separadas: una para el rAAV6 con la plantilla WT HDR y otra para el rAAV6 con la plantilla HDR mutada. En esta sección se describen los pasos necesarios para la preparación de un solo virus.Descongele las células HEK293T, transfiera las células a 10 ml de DMEM precalentado suplementado con 10% FBS, 1% P / S y 25 mM HEPES, y centrifugar a 350 x g a RT durante 5 min. Suspender las células a una concentración de 1 x 105 células/ml y transferirlas a un matraz adecuado (por ejemplo, un matraz de 175 cm2 ). Transferir el matraz a una incubadora a 37 °C/5% deCO2.NOTA: Las células HEK293T deben descongelarse por adelantado para permitir que las células se recuperen completamente y obtengan un número suficiente de células (11 x 107 células son necesarias para la producción de un virus). Se recomienda usar las celdas después de un mínimo de tres pasajes y mantener las celdas por debajo de 20 pasajes. Las células HEK293T deben dividirse tres veces a la semana. Mientras se mantienen las células, estas no deben exceder el 70% -80% de confluencia. El DMEM utilizado en la preparación AAV también debe complementarse con L-glutamina y piruvato de sodio. Recoger las células en un tubo de 50 ml y centrifugar a 350 x g a RT durante 5 min. Suspender las células en 20 mL de DMEM suplementado con 10% FBS, 1% P/S, y 25 mM HEPES y contar con un hemocitómetro. Use azul de tripano para la exclusión de células muertas. Semilla de 3 x 106 células en 20 ml de DMEM suplementado con 10% FBS, 1% P/S y 25 mM HEPES en un matraz de 175 cm2 . Para la producción de un virus, preparar al menos cuatro matraces de 175 cm2 . Incubar las células a 37 °C/5% deCO2 durante 3 días.NOTA: Este paso se realiza mejor un viernes, ya que permite que las células se expandan durante el fin de semana. Cosechar y contar las células HEK293T. Para la preparación de uno de los virus, prepare diez platos de 150 mm cada uno con 11 x 106 HEK293T en 20 ml de DMEM suplementado con 10% FBS, 1% P / S y 25 mM HEPES. Colocar los platos en la incubadora a 37 °C/5%CO2 durante 24 h. Deseche cuidadosamente el medio viejo y reemplácelo con 20 ml de DMEM libre de antibióticos suplementado con 10% de FBS, 25 mM de HEPES y 1 mM de butirato de sodio. Antes de continuar, compruebe que la confluencia de las células no es superior al 80%. Prepare dos tubos de 15 ml que contendrán las mezclas de transfección. Al tubo 1, agregue 5 ml de medio sérico reducido, 60 μg de plásmido HDR mutado rAAV6 y 220 μg de pDGM6 (plásmido auxiliar). Al tubo 2, agregue 5 ml de medio sérico reducido y 1120 μL de solución de polietilenimina de 1 mg/ml (PEI, reactivo de transfección). Agregue el contenido del tubo 2 al tubo 1 y el vórtice durante 30 s. Incubar durante 15 minutos en RT para asegurar la encapsulación adecuada del ADN en las micelas PEI.NOTA: No guarde la solución por más de 20 minutos. Agregue cuidadosamente 1.1 ml de la solución a gota a gota a cada plato y distribúyala girando suavemente. Colocar los platos en la incubadora a 37 °C/5%CO2 durante 48 h. Después de 48 h, agregue 250 μL de EDTA 0.5 M a cada plato y coloque los platos en la incubadora durante 10 min. Coseche las células lavándolas del plato y transfiéralas a un tubo de centrífuga de 500 ml o a varios tubos de 50 ml. Centrifugar a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Para garantizar la eliminación completa del sobrenadante, centrifugar de nuevo a 2.000 x g durante 1 min a 4 °C. Deseche cualquier sobrenadante restante. Cualquier sobrenadante residual podría perjudicar la purificación del virus. Afloje el pellet mediante vórtice y extraiga el virus utilizando un kit de purificación AAV (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Alternativamente, realizar la extracción por ultracentrifugación por gradiente de iodixanol30,31. Alícuota el virus purificado y almacenar a −80 °C. Valorar funcionalmente el VAO o cuantificar el título de VAA mediante PCR digital de gotitas (ddPCR)32 para determinar las condiciones óptimas de transducción. Repita este proceso para la preparación del plásmido rAAV6 WT HDR. Titulación de AAV por ddPCRAntes de empezar, ajuste los bloques calefactores a 65 °C y 98 °C. Extraiga el ADN viral agregando 15 μL de solución de extracción de ADN a 5 μL del virus. Vórtice durante 15 s. Incubar durante 6 min a 65 °C. Vórtice durante 15 s. Incubar durante 2 min a 98 °C. Utilice el ADN extraído (que es una dilución 1:4 del ADN viral) para preparar diluciones seriadas (1:400, 1:40.000, 1:160.000, 1:640.000) conH2Olibre de nucleasa (nf) para la ddPCR.NOTA: Las diluciones pueden almacenarse a -20 °C si la ddPCR no se realiza inmediatamente. Seleccione tres de las diluciones para la ddPCR. La elección de la dilución a utilizar depende de la concentración del virus. Preferiblemente, use tres diluciones diferentes (por ejemplo, 1:40,000, 1:160,000 y 1:640,000) para encontrar la mejor dilución que esté dentro del límite de detección de la máquina. Mantenga los reactivos en hielo mientras trabaja. Prepare una mezcla maestra (todas las muestras se medirán por duplicado). Para cada reacción, prepare lo siguiente: 12,5 μL de ddPCR Supermix para sondas, sin dUTP, 1,25 μL de PrimeTime Std qPCR Assay, AAV-ITR (consulte la Tabla de materiales) y 6,25 μL nf-H2O. Mezclar 5 μL de ADN con 20 μL de la mezcla maestra. Realice esto para las diluciones 1:40.000, 1:160.000 y 1:640.000. Coloque un cartucho en el portacartuchos. Agregue 70 μL de aceite de generación de gotas a las sondas en la fila denominadas Aceite. Tenga cuidado de no generar burbujas. Añadir 20 μL del volumen de muestra en la fila denominada Muestra. Tenga cuidado de no generar burbujas. Selle el cartucho con la junta y colóquelo en el generador de gotas. Genere las gotas presionando el botón de inicio de la máquina, retire la junta y transfiera cuidadosamente, con una pipeta multicanal, 40 μL de las gotas generadas a una placa de 96 pocillos. Trabaje lentamente para evitar la destrucción de las gotitas y las burbujas de aire. Selle la placa de 96 pocillos con una lámina perforada (la franja roja hacia arriba) utilizando el sellador de placas de PCR. Coloque la placa en un termociclador. Ajuste el volumen a 40 μL, la temperatura de la tapa a 105 °C y las velocidades de rampa a 2 °C/s. Ejecute el programa de PCR como se describe en la Tabla 2. Encienda el lector de gotas 30 minutos antes de usarlo. Abra el software en el escritorio. Introduzca el diseño de la placa y seleccione ABS en la pestaña experimento y ddPCR Supermix en la pestaña Supermix. Luego, primero presione PRIME, luego haga clic en FLUSH SYSTEM en el software para iniciar el sistema. Introduzca la placa en el lector. Inicie la ejecución y, cuando haya terminado, exporte los datos como un archivo CSV para su posterior análisis como una hoja de cálculo.NOTA: Los números generados por el software son copias del genoma (GC) por μL. Estos deben multiplicarse por los factores de dilución: GC / μL x 5 (dilución del ADN en la mezcla maestra) x dilución inicial (es decir, 40,000 o 160,000). Figura 3: Descripción esquemática de la orientación intrónica y exónica durante el knock-in CRISPR/Cas9 HDR. Comparación esquemática entre estrategias de orientación intrónica y exónica para CRISPR / Cas9 HDR knock-in. (A) Durante la orientación intrónica, se introduce una ruptura de doble cadena en un intrón del ADN. La plantilla HDR se compone de LHA, secuencia de ADNc y RHA. La focalización intrónica requiere, además, la presencia de un aceptor de rebanadas que contenga el sitio de empalme 3′, el punto de ramificación y el tracto de polipirimidina. Esto permite un empalme correcto. El cuadro punteado verde representa la región correspondiente a la secuencia SA. El tamaño del SA es de 150 pb. (B) La orientación exónica se basa en la producción de una ruptura de doble cadena directamente en el exón. La plantilla HDR se compone de LHA, secuencia de ADNc y RHA. Los recuadros punteados de color naranja indican las regiones correspondientes a la LHA y la RHA. El tamaño ideal de las HA es de 400 pb cada una. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Promotores Nombre Largura Descripción SFFV 492 pb Promotor del virus formador de foco de bazo. Fuerte promotor de mamíferos. Expresado constitutivamente UBC 400 pb Promotor derivado del gen de la ubiquitina C humana. Expresado constitutivamente. CMV 508 pb Promotor derivado del citomegalovirus. Puede contener una región potenciadora. Expresado constitutivamente. Fuerte promotor de mamíferos. Puede ser silenciado. EF-1a 1182 pb Promotor alfa del factor de elongación de la traducción eucariota humana 1. Expresado constitutivamente. Fuerte promotor de mamíferos. EFS 200-300 pb EF-1 alfa forma corta sin intrón CAG 584 pb Promotor híbrido de mamíferos que contiene el potenciador temprano del CMV (C), el promotor de la beta actina del pollo (A) y el aceptor de empalme para el gen de la beta-globina del conejo (G). Expresado constitutivamente. Señales de poliadenilación (PolyA) Abreviatura Largura Descripción SV40 PolyA 82-122 pb Señal de poliadenilación del virus 40 de los simios bGH PolyA 224 pb Señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino rbGlob PolyA 56 pb Señal de poliadenilación de globina beta de conejo Tabla 1: Promotores y señales de poliadenilación. Paso Temperatura Hora Ciclos Activación enzimática 95°C 10 minutos 1x Desnaturalización 94°C 30 segundos 42x Recocido 60°C 1 minuto Extensión 72°C 30 segundos Desactivación enzimática 98°C 10 minutos 1x Sostener 4°C ∞ Tabla 2: Programa de PCR de gotitas digitales. 3. Edición de HSPC Transfección y transducción de HSPCsDescongele las HSPC CD34+ y transfiera las células a 10 ml de RPMI precalentado suplementado con 1% P/S. Centrifugadora a 350 x g a RT durante 10 min. Suspender las células en medio de retención de HSPC hasta una concentración de 2,5 x 10 5 células/ml e incubar a 37 °C/5 % de CO2 durante 48 h -72 h. Cosechar las células en un tubo de 15 ml. Contar las celdas y comprobar la viabilidad celular mediante la exclusión de azul de tripano. Entre 2 x 10 5 y5 x 106 células pueden ser nucleofecadas en una sola cubeta. Prepare el número apropiado de cubetas dependiendo de su número de celda calculado. Preparar el complejo RNP. En un tubo de 1,5 ml, añadir 15 μg de Cas9 y 8 μg de sgRNA (relación molar 1:2,5) e incubar a 25 °C durante 10 min en un bloque de calentamiento. Mientras el complejo RNP está incubando, centrifugar las células a 350 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Suspender las células en 100 μL de solución de nucleofección. Mezclar las células con el complejo RNP y transferir a la cubeta. Golpee suavemente la cubeta para eliminar cualquier burbuja de aire residual que pueda haberse formado durante la transferencia. Inserte la cubeta en el soporte del sistema de transfección y electropolara las células como se describió anteriormente en la sección de diseño de sgRNA. Inmediatamente después de la electroporación, añadir 400 μL de medio de retención de HSPC precalentado sin P/S y transferir las células con una pipeta de transferencia fina a una placa de cultivo tisular que contenga 500 μL de medio de retención de HSPC precalentado sin P/S. Dependiendo del número de células, utilice una placa de cultivo adecuada (placa de 24, 12 o 6 pocillos) para alcanzar una densidad entre 0,25 x 10 6 y 1 x 106 células/ml. Transfiera la placa a la incubadora a 37 °C/5% deCO2. Descongele los viales que contienen los rAAV congelados en hielo. Transducir las células pipeteando la cantidad óptima de cada rAAV6 a la suspensión celular. Realice la transducción dentro de los 20-30 minutos posteriores a la electroporación para obtener altas eficiencias de transducción.NOTA: La concentración óptima de cada virus (un virus para la plantilla WT HDR y otro virus separado para la plantilla HDR mutada) debe determinarse experimentalmente. Por lo general, 5,000-10,000 GC / célula (por ejemplo, 5 x 109 GC para 1 x 106 células) dan como resultado una alta transducción. Mezclar suavemente la suspensión celular con la pipeta. Incubar las células transducidas durante 6-8 h a 37 °C/5% deCO2. Después de 6-8 h, recoger las células en un tubo y centrifugar a 350 x g a RT durante 5 min. Deseche el medio viejo y reemplácelo con un medio de retención de HSPC fresco precalentado complementado con P/S. Suspender las células a una concentración entre 2,5 x 10 5-5 x 105 células/ml y transferirlas a una placa de cultivo celular tratada con tejido (placa de 24, 12 o 6 pocillos). Incubar las células durante 48 h a 37 °C/5% deCO2 antes de proceder a la clasificación. Clasificación de flujo de las HSPC diseñadas portadoras de la mutación GOF heterocigóticaCosechar las células en un tubo de 15 ml y centrifugar a 350 x g a RT durante 5 min. Retire el sobrenadante, suspenda las células en 1 ml de DPBS que contenga 0,1% de BSA y centrifugar nuevamente a 350 x g a RT durante 5 min. Deseche el sobrenadante y suspenda las células en un volumen apropiado de DPBS + 0,1% BSA dependiendo del número de células.NOTA: Se recomienda suspender las celdas a un volumen mínimo de 200 μL y no exceder 1 x 107 células/ml para reducir el riesgo de obstrucción del clasificador. Transfiera las células a un tubo FACS estéril equipado con una tapa. Agregue 7-AAD u otro colorante de viabilidad (dependiendo de su compatibilidad con las proteínas fluorescentes) a la suspensión celular para la exclusión de células vivas / muertas. Clasificar las células vivas que son doblemente positivas para las proteínas reporteras fluorescentes en un tubo de recolección que contenga 200 μL de medio de retención HSPC.NOTA: Se deben agregar controles apropiados que consistan en celdas que solo se transducen con AAV para garantizar la activación adecuada durante el procedimiento de clasificación. Centrifugar las células clasificadas a 350 x g a RT durante 5 min y suspender las células en medio de retención HSPC a una concentración de 2,5 x 105 células/ml para una mayor expansión en cultivo o utilizar las células directamente para ensayos funcionales. 4. Confirmación de la edición exitosa de genes Extracción de ADN genómicoAntes de empezar, ajuste los bloques calefactores a 65 °C y 98 °C. Cosechar 2 x 10 5 células editadas y clasificadas por el genoma y centrifugar a 350 x g durante5 min. Extraiga el ADNg como se describió anteriormente. Utilice la solución de ADN directamente para PCR o guárdela a -20 °C. In-Out PCRDiseñar dos cebadores para amplificar el sitio de inserción 5′ (Figura 4A): el cebador hacia adelante 1 se dirige al locus genómico fuera del brazo de homología izquierdo; El cebador inverso 2 se dirige a la secuencia integrada. Para la PCR de entrada-salida, prepare la siguiente mezcla de PCR por reacción:10 μL de PCR Master Mix (2x; ver Tabla de materiales)1 μL de cebador hacia adelante 1 (material de 10 μM)1 μL de imprimación inversa 2 (material de 10 μM)0.5-1.0 μL de ADN extraídoH2Olibre de nucleasa hasta un volumen final de 20 μLNOTA: Para más de una reacción, es aconsejable preparar una mezcla maestra que contenga una reacción adicional para tener en cuenta los errores de pipeteo. Es importante incluir un control no plantilla y un ADN de plantilla de una muestra tratada simulada. Ejecute las reacciones de PCR con el programa de ciclo térmico adecuado (consulte las instrucciones del fabricante).NOTA: Es aconsejable probar primero el par de cebadores para la temperatura óptima de recocido. Esto se puede hacer calculando el Tm y luego ejecutando la PCR con un termociclador que puede realizar un gradiente de temperatura. Ejecute los productos de PCR con una escalera de ADN en un gel de agarosa al 1,5% a 100 V durante 45-60 min (Figura 4B). Coloque el gel sobre un transiluminador de luz azul o UV. Extirpar las bandas del gel. Extraiga el ADN de las bandas utilizando un kit de extracción de gel de ADN. Enviar las muestras de PCR extraídas con los cebadores apropiados para la secuenciación de Sanger para confirmar la integración correcta y perfecta del ADNc deseado en el locus del gen endógeno. Figura 4: Validación de la integración genómica por PCR in-out. (A) Representación esquemática de la estrategia de PCR in-out. En la estrategia descrita, se diseñaron dos imprimaciones. El cebador hacia adelante 1 se dirige al locus genómico fuera de la LHA, y el cebador inverso 2 se dirige a la secuencia optimizada para codón. (B) Representación esquemática de una electroforesis en gel de agarosa. Solo las células editadas con éxito (RNP + AAV) generarán un producto de PCR durante la PCR de entrada-salida, mientras que las muestras no editadas (solo AAV) no generarán un producto de PCR. Abreviatura: NTC = control sin plantilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.