Pulldown-Assay gekoppelt mit Co-Expression in Bakterienzellen als zeiteffizientes Werkzeug zum Testen anspruchsvoller Protein-Protein-Interaktionen

Konventioneller Pulldown wird häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen¹. Gereinigte Proteine interagieren jedoch oft nicht effektiv in vitro^2,3, und einige von ihnen sind ohne ihren Bindungspartner ^4,5 unlöslich. Solche Proteine könnten eine co-translationale Assemblierung oder das Vorhandensein von molekularen Chaperonen 5,6,7,8,9 erfordern. Eine weitere Einschränkung des konventionellen Pulldowns ist die Prüfung möglicher Heteromultimerisierungsaktivität zwischen Domänen, die als stabile Homo-Oligomere existieren können, die kotranslational zusammengesetzt sind ^8,10, da viele von ihnen während der Inkubationszeit in vitro nicht dissoziieren und reassoziieren können. Die Koexpression erwies sich als nützlich bei der Überwindung solcher Probleme ^3,11. Die Koexpression unter Verwendung kompatibler Vektoren in Bakterien wurde erfolgreich zur Aufreinigung großer makromolekularer Komplexe mit mehreren Untereinheiten eingesetzt, einschließlich des Polycomb-Repressionskomplexes PRC2 12, des RNA-Polymerase-II-Mediatorkopfmoduls¹³, der Bakteriophagen-T4-Grundplatte¹⁴, des SAGA-Komplex-Deubiquitinylase-Moduls 15,16 und des Ferritins ¹⁷. Replikationsursprünge, die üblicherweise für die Koexpression verwendet werden, sind ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ und RSF²⁰. Im kommerziell erhältlichen Duet-Expressionssystem werden diese Ursprünge mit verschiedenen Antibiotikaresistenzgenen und geeigneten multiplen Klonierungsstellen kombiniert, um polycistronische Vektoren zu erzeugen, die die Expression von bis zu acht Proteinen ermöglichen. Diese Ursprünge haben unterschiedliche Kopienzahlen und können in unterschiedlichen Kombinationen verwendet werden, um ausgewogene Expressionsniveaus von Zielproteinen^{zu erreichen 21}. Um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu testen, werden verschiedene Affinitäts-Tags verwendet; die gebräuchlichsten sind 6xHistidin, Glutathion-S-Transferase (GST) und Maltose-bindendes Protein (MBP), von denen jedes eine spezifische Affinität zum entsprechenden Harz aufweist. GST und MBP verbessern auch die Löslichkeit und Stabilität von markierten Proteinen²².

Es wurde auch eine Reihe von Methoden entwickelt, die die Koexpression von Proteinen in eukaryotischen Zellen beinhalten, von denen die bekannteste der Hefe-Zwei-Hybrid-Assay (Y2H) ^ist23. Der Y2H-Assay ist kostengünstig, einfach und ermöglicht das Testen mehrerer Interaktionen. Der Workflow dauert jedoch mehr als 1 Woche. Es gibt auch einige weniger häufig verwendete Säugetierzell-basierte Assays, z. B. den Fluoreszenz-Zwei-Hybrid-Assay (F2H)²⁴ und den Zellarray-Protein-Protein-Interaktions-Assay (CAPPIA)²⁵. Der F2H-Assay ist relativ schnell und ermöglicht die Beobachtung von Proteininteraktionen in ihrer nativen zellulären Umgebung, erfordert jedoch die Verwendung teurer Bildgebungsgeräte. Alle diese Methoden haben einen Vorteil gegenüber der prokaryotischen Expression, die die native eukaryotische Translations- und Faltungsumgebung bereitstellt. Sie erkennen jedoch indirekt eine Interaktion, entweder durch transkriptionelle Aktivierung oder durch Fluoreszenzenergietransfer, wodurch häufig Artefakte entstehen. Eukaryotische Zellen können auch andere Interaktionspartner von Proteinen von Interesse enthalten, die das Testen binärer Wechselwirkungen zwischen Proteinen höherer Eukaryoten stören können.

Die vorliegende Arbeit beschreibt eine Methode zur bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen, gefolgt von konventionellen Pulldown-Techniken. Die Methode ermöglicht es, Wechselwirkungen zwischen Zielproteinen zu untersuchen, die eine Koexpression erfordern. Es ist im Vergleich zu herkömmlichem Pulldown zeiteffizienter und ermöglicht das Testen mehrerer Ziele, was es in den meisten Fällen vorteilhaft macht. Die Koexpression mit kompatiblen Vektoren ist bequemer als die polycistronische Co-Expression, da sie keinen mühsamen Klonschritt erfordert.