Summary

Microdialysis System을 사용한 의식이 있는 쥐의 해마 세포외 유체의 실시간 동적 수집

Published: October 21, 2022
doi:

Summary

여기서 프로토콜은 미세 투석 시스템을 사용하여 깨어 있는 쥐의 해마에서 세포외액의 상세한 실시간 동적 샘플링을 제공합니다.

Abstract

다양한 중추신경계(CNS) 질환은 해마 세포외액(HECF) 구성의 변화와 관련이 있습니다. 그러나 의식이 있는 쥐로부터 실시간으로 HECF를 얻는 데 어려움이 있어 CNS 질병 진행 평가와 민족의학 요법의 효과가 오랫동안 제한되어 왔습니다. 고무적으로, 뇌 미세 투석 기술은 동적 관찰, 정량 분석 및 작은 샘플링 크기의 장점으로 연속 샘플링에 사용될 수 있습니다. 이를 통해 살아있는 동물의 뇌에서 전통적인 허브의 화합물과 대사 산물에 대한 세포 외액 함량의 변화를 모니터링 할 수 있습니다. 따라서 이 연구의 목적은 3차원 뇌 정위 장치를 사용하여 Sprague Dawley(SD) 쥐의 해마 영역에 뇌척수액 미세 투석 프로브를 정확하게 이식하여 20kDa 이상의 분자량을 차단하는 것이었습니다. 그런 다음 2.87nL/min – 2.98mL/min에서 샘플링 속도를 조정할 수 있는 미세 투석 샘플링 제어 시스템을 사용하여 의식이 있는 쥐로부터 고품질 HECF를 얻었습니다. 결론적으로, 우리의 프로토콜은 미세 투석 기술의 도움으로 깨어 있는 쥐에서 HECF를 얻을 수 있는 효율적이고 신속하며 역동적인 방법을 제공하여 CNS 관련 질병의 발병기전을 추가로 탐색하고 약물 효능을 평가할 수 있는 무한한 가능성을 제공합니다.

Introduction

신경퇴행성 질환, 외상성 뇌 손상, 고지대 저산소증으로 인한 뇌 손상 및 허혈성 뇌졸중과 같이 이환율이 높은 중추신경계(CNS) 질환은 전 세계적으로 사망률이 증가하는 중요한 원인입니다 1,2,3. 특정 뇌 영역의 사이토카인 및 단백질 변화의 실시간 모니터링은 중추신경계 질환의 진단 정확도와 투약 후 뇌 약동학 연구에 기여합니다. 전통적인 과학 연구는 특정 물질의 검출 및 약동학 연구를 위해 뇌 조직 균질액 또는 동물 간질 뇌액의 수동 수집을 사용합니다. 그러나 이것은 제한된 표본 크기, 지표의 변화를 동적으로 관찰할 수 없음, 고르지 않은 표본 추출 품질 4,5,6과 같은 몇 가지 단점이 있습니다. 간질액인 뇌척수액은 뇌와 척수를 기계적 손상으로부터 보호합니다. 그 구성은 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 존재로 인해 혈청의 구성과 다릅니다.7. 뇌척수액 샘플의 직접 분석은 CNS 병변 및 약물 발견의 메커니즘을 밝히는 데 더 도움이 됩니다. 필연적으로, 주사기를 통해 수조 마그나 및 뇌실에서 직접 수동으로 얻은 뇌척수액 샘플은 혈액 오염의 단점, 무작위 샘플 수집 기회, 수량의 불확실성 및 다중 검색 가능성이 거의 없습니다 8,9. 특히, 기존의 간질성 뇌액 샘플링 방법은 손상된 뇌 영역에서 샘플을 얻을 수 없어 특정 뇌 영역에서 CNS 질환의 발병기전을 탐색하고 표적 민족 의학 요법의 효능 평가를 방해합니다 9,10.

뇌 미세투석(brain microdialysis)은 깨어 있는 동물에서 간질성 뇌액을 채취하는 기술이다11. 미세 투석 시스템은 뇌에 이식 된 프로브의 도움으로 혈관 투과성을 모방합니다. 미세 투석 프로브는 반투과성 막으로 무장하고 특정 뇌 영역에 이식됩니다. 등장성 인공 뇌척수액(African artificial cerebrospinal fluid, ACSF)으로 관류한 후, 투석된 간질성 뇌액은 작은 표본 크기, 연속적인 샘플링 및 동적 관찰의 이점으로 유리하게 수집될 수 있다12,13. 위치 측면에서, 뇌 미세투석 프로브는 관심 있는 뇌 구조 또는 두개골 수조에 선택적으로 이식될 수 있다14. 해마 세포 외액 (HECF)에서 내인성 물질의 비정상적인 수준을 관찰하면 CNS 질환의 발생 또는 질병의 발병 기전을 알 수 있습니다. 여러 연구에 따르면 정신분열증의 D-아미노산, 알츠하이머병의 β-아밀로이드 및 타우 단백질, 외상성 뇌 손상의 신경필라멘트 경쇄, 저산소성 허혈성 뇌병증의 유비퀴틴 카르복시 말단 가수분해효소 L1과 같은 CNS 질환에 대한 바이오마커를 뇌척수액에서 분석할 수 있습니다15,16,17 . 뇌 미세투석 샘플링 기법에 기초한 화학 분석 방법을 사용하여 특정 뇌 영역에서 확산 및 분포하는 민족 의학의 활성 성분과 같은 외인성 화합물의 동적 변화를 모니터링할 수 있다14.

이 기사는 깨어 있는 쥐에서 동적 HECF 획득의 특정 과정을 제시하고 샘플 품질을 보장하기 위해 삼투압을 측정합니다.

Protocol

실험 프로토콜은 청두 한의과대학 실험동물 사용 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회(기록 번호: 2021-11)의 요구 사항에 따라 수행되었습니다. 수컷 Sprague Dawley (SD) 래트(280 ± 20 g, 6-8주령)를 본 연구에 사용하였다. 1. 뇌 미세 투석 프로브 이식 수술 쥐 마취의 유도 및 유지를 위해 각각 3% 및 1.5% 이소플루란을 사용하고 0.6L/min의 공기-산소 혼합물에서 동물 마취…

Representative Results

상기 실험 프로토콜 및 표 1에 설정된 샘플링 파라미터에 따라, 설정된 샘플링 속도에서 물-유사, 무색 및 투명 래트 HECF를 수득하였다(도 1K). 수득 된 쥐 HECF의 삼투압은 290-310 mOsm / L이며, 이는 간접적으로 샘플18,19의 품질을 보장 할 수있다. <img alt="Figure 1" class="xfigi…

Discussion

중추 신경계 질환의 발병 기전은 아직 완전히 이해되지 않아 새로운 치료법과 약물 개발을 방해합니다. 연구에 따르면 대부분의 CNS 질환은 해마 병변과 밀접한 관련이 있습니다20,21,22. 제안 된 뇌 미세 투석 기술은 뇌의 특정 영역, 특히 해마를 표적으로 삼을 수 있으므로 HECF를 수집하는 전통적인 접근 방식에서 두드러집니다….

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82104533), 쓰촨성 과학 기술부 (2021YJ0175) 및 중국 박사후 과학 재단 (2020M683273)의 지원을 받았습니다. 저자는 Tri-Angels D&H Trading Pte.의 선임 장비 엔지니어인 Mr. Yuncheng Hong에게 감사의 말을 전합니다. Ltd. (싱가포르)는 미세 투석 기술에 대한 기술 서비스를 제공합니다.

Materials

 Air-drying oven Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd GHG-9240A
Animal anesthesia system Rayward Life Technology Co., Ltd R500IE
Animal temperature maintainer Rayward Life Technology Co., Ltd 69020
Artificial cerebrospinal fluid Beijing leagene biotech. Co., Ltd CZ0522
Brain microdialysis probe  CMA Microdialysis AB T56518
Catheter  CMA Microdialysis AB T56518
Covance infusion harness Instech Laboratories, Inc. CIH95
Denture base resins Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd 190732
Electric cranial drill Rayward Life Technology Co., Ltd 78001
Electric shaver Rayward Life Technology Co., Ltd CP-5200
Free movement tank for animals  CMA Microdialysis AB CMA120
Heparin sodium injection Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd H51021208
Iodophor Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd 202201
Isofluran Rayward Life Technology Co., Ltd R510-22
Microdialysis catheter stylet  CMA Microdialysis AB 8011205
Microdialysis collection tube  CMA Microdialysis AB 7431100
Microdialysis collector  CMA Microdialysis AB CMA4004
Microdialysis fep tubing  CMA Microdialysis AB 3409501
Microdialysis in vitro stand  CMA Microdialysis AB CMA130
Microdialysis microinjection pump  CMA Microdialysis AB 788130
Microdialysis syringe (1.0 mL)  CMA Microdialysis AB 8309020
Microdialysis tubing adapter  CMA Microdialysis AB 3409500
Non-absorbable surgical sutures Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd S19004
Ophthalmic forceps Rayward Life Technology Co., Ltd F12016-15
Osmometer Löser OM 807
Sodium hyaluronate eye drops URSAPHARM Arzneimittel GmbH H20150150
Stereotaxie apparatus Rayward Life Technology Co., Ltd 68025
Surgical scissors Rayward Life Technology Co., Ltd S14014-15
Surgical scissors Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd BY-103
Syringe needle  CMA Microdialysis AB T56518
Trypsin solution Boster
Biological Technology, Ltd.
PYG0107
Ultrasonic cleaner Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd KMH1-240W8101

Referências

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Wang, X., Xie, N., Zhang, Y., Meng, X., Hou, Y., Zhang, S. Real-Time Dynamic Collection of Hippocampal Extracellular Fluid from Conscious Rats Using a Microdialysis System. J. Vis. Exp. (188), e64530, doi:10.3791/64530 (2022).

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