Live-cellavbildning av intakta ex vivo-glober med en ny 3D-tryckt hållare
Summary
Det aktuella arbetet beskriver ett nytt experimentellt protokoll som använder en 3D-tryckt hållare för att möjliggöra högupplöst levande cellavbildning av enucleated glober. Genom detta protokoll kan den cellulära kalciumsignalaktiviteten i sårat hornhinneepitel från ex vivo-glober observeras i realtid.
Abstract
Corneal epitelial sårläkning är en migrerande process som initieras genom aktivering av purinerga receptorer uttryckta på epitelceller. Denna aktivering resulterar i kalciummobiliseringshändelser som sprider sig från cell till cell, vilket är viktigt för att initiera cellulär rörlighet i sårbädden, vilket främjar effektiv sårläkning. Trinkaus-Randall-labbet har utvecklat en metod för att avbilda hornhinnans sårläkningssvar i ex vivo murina jordklot i realtid. Detta tillvägagångssätt innebär att man enucleing en intakt jordklot från en mus som har avlivats enligt etablerade protokoll och omedelbart inkuberar jordklotet med ett kalciumindikatorfärgämne. En motfärg som fläckar andra funktioner i cellen kan appliceras i detta skede för att hjälpa till med avbildning och visa cellulära landmärken. Protokollet fungerade bra med flera olika levande cellfärger som används för motfärgning, inklusive SiR-aktin för att färga aktin och djupröd plasmamembranfläck för att färga cellmembranet. För att undersöka svaret på ett sår skadas hornhinneepitelet med en 25 G-nål och kloten placeras i en 3D-tryckt hållare. Dimensionerna på den 3D-tryckta hållaren är kalibrerade för att säkerställa immobilisering av jordklotet under hela experimentets varaktighet och kan modifieras för att rymma ögon i olika storlekar. Levande cellavbildning av sårsvaret utförs kontinuerligt på olika djup i vävnaden över tid med hjälp av konfokalmikroskopi. Detta protokoll gör det möjligt för oss att generera högupplösta bilder av publikationskvalitet med ett 20x luftmål på ett konfokalmikroskop. Andra mål kan också användas för detta protokoll. Det representerar en signifikant förbättring av kvaliteten på levande cellavbildning i ex vivo murina jordklot och möjliggör identifiering av nerver och epitel.
Introduction
Hornhinna
Hornhinnan är en klar, avaskulär struktur som täcker ögats främre yta som bryter ljus för att möjliggöra syn och skyddar ögats inre från skador. Eftersom hornhinnan utsätts för miljön är den mottaglig för skador från både mekaniska orsaker (repor) och från infektion. En hornhinneskada hos en annars frisk patient läker vanligtvis inom 1-3 dagar. Men hos patienter med underliggande tillstånd inklusive limbal stamcellsbrist och typ II-diabetes kan hornhinnans sårläkningsprocess förlängas kraftigt1. Eftersom hornhinnan är mycket innerverad är dessa icke-helande hornhinnesår och återkommande hornhinneerosioner mycket smärtsamma och minskar kraftigt livskvaliteten hos patienter som upplever dem1.
Cell signalering
När en i övrigt frisk hornhinna skadas föregår kalciumsignaleringshändelser i cellerna intill såret och föranleder cellulär migration in i sårbädden, där de stänger skadan utan risk för ärrbildning 2,3. Dessa signalhändelser har karakteriserats väl i hornhinneepitelcellodlingsmodeller med hjälp av levande cellavbildning2. Preliminära experiment visar signifikant mer kalciumsignalering efter skada i icke-diabetiska celler jämfört med diabetesceller. Karakterisering av cellsignaleringshändelserna i ex vivo-glober har dock visat sig vara en teknisk utmaning.
Avbildning av levande celler
Tidigare studier har framgångsrikt registrerat kalciumsignaleringshändelser från in vitro-cellodlingsmodeller av hornhinnesårläkning 4,5,6. Att utveckla en metod för att producera högkvalitativa bilder av dessa signalhändelser i ex vivo-vävnad är av stort intresse eftersom det skulle göra det möjligt att studera dessa händelser i ett mer komplext och verklighetstroget system. Tidigare tillvägagångssätt har involverat dissektion av hornhinnan följt av immobilisering i en UV-inducerad PEG-gel 7,8,9. Immobilisering är ett viktigt men utmanande steg när man arbetar med levande vävnad, eftersom det måste förbli livskraftigt och hydratiserat under hela experimentets gång. Dessutom får immobilisering inte skada vävnaden. Medan PEG-lösningen immobiliserade vävnaden var upplösningen och kvaliteten på de producerade bilderna inte konsekventa. Därför utvecklades 3D-tryckta hållare för att immobilisera intakta jordklot för att producera bilder av högre kvalitet med mindre risk för vävnadsskador.
Tillvägagångssättet
En unik 3D-tryckt hållare utvecklades för att immobilisera intakta ex vivo-glober för levande cellavbildning. Denna hållare förhindrar skador från två huvudkällor: det möjliggör avbildning av en enucleated globe utan att behöva dissekera hornhinnan, och det eliminerar exponering för UV-ljus. Utan dessa skadekällor representerade de erhållna bilderna mer exakt svaret på repskadorna som gjordes experimentellt. Dessutom kalibrerades den 3D-tryckta hållaren till de exakta måtten på det murina ögat. Detta gav en mycket bättre passform än immobilisering i PEG-lösningen, vilket ledde till en bild av högre kvalitet vid lägre effektmål på grund av minskad vävnadsrörelse. En täckstång fäst på toppen av hållaren säkerställer att jordklotet förblir orörligt under hela experimentets varaktighet och att det inte finns någon förskjutning av jordklotet när tillväxtmedier appliceras för att upprätthålla hydrering och livskraft. Möjligheten att skriva ut hållaren till exakta dimensioner gör det också möjligt för oss att skapa en optimal passform för murina ögon i olika storlekar på grund av ålder eller sjukdomsstatus. Denna teknik kan tillämpas bredare för att utveckla hållare för olika arters ögon baserat på deras dimensioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en levande cellavbildningsteknik som använder en 3D-tryckt hållare för att stabilisera och immobilisera intakta djurögon. Den är utformad för att kringgå flera signifikanta nackdelar som erkänns med tidigare levande cellavbildningsprotokoll för ex vivo hornhinnevävnad. Detta protokoll erbjuder många fördelar för levande cellavbildning av intakta jordklot. Det minskar avsevärt onödiga vävnadsskador som kan störa sårläkningssvaret på experimentellt inducerade repsår. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka NIH för följande bidragsstöd: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) och 5T32GM008541-24 (KS). Vi vill också uppmärksamma Massachusetts Lions Eye Research Fund och New England Corneal Transplant Fund.
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
Referências
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengenharia. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
