Levende cellebilleddannelse af intakte ex vivo glober ved hjælp af en ny 3D-trykt holder
Summary
Det nuværende arbejde beskriver en ny eksperimentel protokol, der bruger en 3D-trykt holder til at muliggøre højopløsnings levende cellebilleddannelse af enukleerede kloder. Gennem denne protokol kan den cellulære calciumsignalaktivitet i såret hornhindeepitel fra ex vivo-kloder observeres i realtid.
Abstract
Hornhindepitelsårheling er en migrationsproces initieret ved aktivering af purinerge receptorer udtrykt på epitelceller. Denne aktivering resulterer i calciummobiliseringshændelser, der forplanter sig fra celle til celle, som er afgørende for at initiere cellulær bevægelighed i sårlejet og fremme effektiv sårheling. Trinkaus-Randall-laboratoriet har udviklet en metode til billeddannelse af hornhindesårhelingsresponsen i ex vivo murine glober i realtid. Denne tilgang indebærer at enukleere en intakt klode fra en mus, der er blevet aflivet i henhold til etablerede protokoller og straks inkubere kloden med et calciumindikatorfarvestof. En modfarve, der pletter andre funktioner i cellen, kan anvendes på dette stadium for at hjælpe med billeddannelse og vise cellulære vartegn. Protokollen fungerede godt med flere forskellige levende cellefarvestoffer, der blev brugt til modfarvning, herunder SiR actin til at plette actin og dyb rød plasmamembranplet til at plette cellemembranen. For at undersøge reaktionen på et sår skades hornhindeepitelet ved hjælp af en 25 G-nål, og kuglerne placeres i en 3D-trykt holder. Dimensionerne på den 3D-printede holder er kalibreret for at sikre immobilisering af kloden i hele eksperimentets varighed og kan ændres til at rumme øjne i forskellige størrelser. Levende cellebilleddannelse af sårresponsen udføres kontinuerligt på forskellige dybder i hele vævet over tid ved hjælp af konfokal mikroskopi. Denne protokol giver os mulighed for at generere billeder i høj opløsning i publikationskvalitet ved hjælp af et 20x luftmål på et konfokalmikroskop. Andre mål kan også bruges til denne protokol. Det repræsenterer en betydelig forbedring af kvaliteten af levende cellebilleddannelse i ex vivo murine glober og gør det muligt at identificere nerver og epitel.
Introduction
Hornhinde
Hornhinden er en klar, avaskulær struktur, der dækker øjets forreste overflade, der bryder lys for at muliggøre syn og beskytter det indre af øjet mod skader. Da hornhinden udsættes for miljøet, er den modtagelig for skader fra både mekaniske årsager (ridser) og fra infektion. En hornhindeskade hos en ellers sund patient heler typisk inden for 1-3 dage. Hos patienter med underliggende tilstande, herunder limbal stamcellemangel og type II-diabetes, kan hornhindesårhelingsprocessen imidlertid forlænges meget1. Da hornhinden er meget innerveret, er disse ikke-helbredende hornhindesår og tilbagevendende hornhindeerosioner meget smertefulde og mindsker i høj grad livskvaliteten for patienter, der oplever dem1.
Celle signalering
Når en ellers sund hornhinde er skadet, går calciumsignaleringshændelser i cellerne ved siden af såret forud og beder cellulær migration ind i sårlejet, hvor de lukker skaden uden risiko for ardannelse 2,3. Disse signalhændelser er blevet godt karakteriseret i hornhindepitelcellekulturmodeller ved hjælp af levende cellebilleddannelse2. Foreløbige forsøg viser signifikant mere calciumsignalering efter skade i ikke-diabetiske celler sammenlignet med diabetiske celler. Karakterisering af cellesignaleringshændelserne i ex vivo-kloder har imidlertid vist sig at være en teknisk udfordring.
Billeddannelse af levende celler
Tidligere undersøgelser har med succes registreret calciumsignaleringshændelser fra in vitro-cellekulturmodeller af hornhindesårheling 4,5,6. Udvikling af en metode til fremstilling af billeder af høj kvalitet af disse signalhændelser i ex vivo-væv er af stor interesse, fordi det ville gøre det muligt at studere disse begivenheder i et mere komplekst og virkelighedstro system. Tidligere tilgange har involveret dissektion af hornhinden efterfulgt af immobilisering i en UV-induceret PEG-gel 7,8,9. Immobilisering er et vigtigt, men udfordrende trin, når man arbejder med levende væv, da det skal forblive levedygtigt og hydreret i løbet af eksperimentet. Desuden må immobilisering ikke beskadige vævet. Mens PEG-løsningen immobiliserede vævet, var opløsningen og kvaliteten af de producerede billeder ikke konsistent. Derfor blev 3D-printede holdere udviklet til at immobilisere intakte kloder for at producere billeder af højere kvalitet med mindre risiko for vævsskade.
Tilgangen
En unik 3D-printet holder blev udviklet til at immobilisere intakte ex vivo-kloder til levende cellebilleddannelse. Denne holder forhindrer skader fra to hovedkilder: det giver mulighed for billeddannelse af en enukleeret klode uden behov for at dissekere hornhinden, og det eliminerer udsættelse for UV-lys. Uden disse skadekilder repræsenterede de opnåede billeder mere præcist reaktionen på de ridseskader, der blev foretaget eksperimentelt. Desuden blev den 3D-printede holder kalibreret til murineøjets præcise dimensioner. Dette gav en meget bedre pasform end immobilisering i PEG-løsning, hvilket førte til et billede af højere kvalitet ved lavere drevne mål på grund af nedsat vævsbevægelse. En dækstang, der er fastgjort til toppen af holderen, sikrer, at kloden forbliver ubevægelig i hele eksperimentets varighed, og at der ikke er nogen forskydning af kloden, når vækstmedier påføres for at opretholde hydrering og levedygtighed. Evnen til at udskrive holderen til præcise dimensioner giver os også mulighed for at generere en optimal pasform til murine øjne i forskellige størrelser på grund af alder eller sygdomsstatus. Denne teknologi kan anvendes mere bredt til at udvikle holdere til forskellige arters øjne baseret på deres dimensioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en levende cellebilleddannelsesteknik, der bruger en 3D-trykt holder til at stabilisere og immobilisere intakte dyreøjne. Det er designet til at omgå flere væsentlige ulemper, der er anerkendt med tidligere levende cellebilleddannelsesprotokoller af ex vivo hornhindevæv. Denne protokol giver mange fordele for levende cellebilleddannelse af intakte kloder. Det reducerer unødvendig vævsskade betydeligt, der kan forstyrre sårhelingsresponset på eksperimentelt inducerede ridsesår. D…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende NIH for følgende tilskudsstøtte: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) og 5T32GM008541-24 (KS). Vi vil også gerne anerkende Massachusetts Lions Eye Research Fund og New England Corneal Transplant Fund.
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
Referências
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengenharia. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
