Live-cell beeldvorming van intacte Ex Vivo Globes met behulp van een nieuwe 3D-geprinte houder
Summary
Het huidige werk beschrijft een nieuw experimenteel protocol dat een 3D-geprinte houder gebruikt om live cell imaging met hoge resolutie van enucleated globes mogelijk te maken. Via dit protocol kan de cellulaire calciumsignaleringsactiviteit in gewond hoornvliesepitheel van ex vivo globes in realtime worden waargenomen.
Abstract
Cornea-epitheliale wondgenezing is een migratieproces dat wordt geïnitieerd door de activering van purinerge receptoren die tot expressie komen op epitheelcellen. Deze activering resulteert in calciummobilisatiegebeurtenissen die zich van cel naar cel voortplanten, die essentieel zijn voor het initiëren van cellulaire beweeglijkheid in het wondbed, waardoor efficiënte wondgenezing wordt bevorderd. Het Trinkaus-Randall-lab heeft een methodologie ontwikkeld voor het in beeld brengen van de genezingsrespons van de hoornvlieswond in ex vivo muizenbollen in realtime. Deze aanpak omvat het enucleren van een intacte wereldbol van een muis die volgens vastgestelde protocollen is geëuthanaseerd en onmiddellijk de wereld incuberen met een calciumindicatorkleurstof. Een counterstain die andere kenmerken van de cel kleurt, kan in dit stadium worden toegepast om te helpen bij beeldvorming en cellulaire oriëntatiepunten te tonen. Het protocol werkte goed met verschillende levende celkleurstoffen die worden gebruikt voor counterstaining, waaronder SiR-actine om actine te kleuren en dieprode plasmamembraanvlek om het celmembraan te kleuren. Om de reactie op een wond te onderzoeken, wordt het hoornvliesepitheel verwond met behulp van een naald van 25 G en worden de bollen in een 3D-geprinte houder geplaatst. De afmetingen van de 3D-geprinte houder zijn gekalibreerd om immobilisatie van de wereldbol gedurende de duur van het experiment te garanderen en kunnen worden aangepast aan ogen van verschillende groottes. Live cell imaging van de wondrespons wordt continu uitgevoerd op verschillende diepten in het weefsel in de loop van de tijd met behulp van confocale microscopie. Dit protocol stelt ons in staat om beelden van hoge resolutie, publicatiekwaliteit te genereren met behulp van een 20x luchtdoel op een confocale microscoop. Voor dit protocol kunnen ook andere doelstellingen worden gebruikt. Het vertegenwoordigt een aanzienlijke verbetering van de kwaliteit van live cell imaging in ex vivo muizenbollen en maakt de identificatie van zenuwen en epitheel mogelijk.
Introduction
Hoornvlies
Het hoornvlies is een heldere, avasculaire structuur die het voorste oppervlak van het oog bedekt en die licht breekt om het zicht mogelijk te maken en het binnenste van het oog beschermt tegen schade. Omdat het hoornvlies wordt blootgesteld aan de omgeving, is het gevoelig voor schade door zowel mechanische oorzaken (krabben) als door infectie. Een hoornvliesletsel bij een verder gezonde patiënt geneest meestal binnen 1-3 dagen. Bij patiënten met onderliggende aandoeningen, waaronder limbale stamceldeficiëntie en diabetes type II, kan het genezingsproces van de hoornvlieswond echter sterk worden verlengd1. Omdat het hoornvlies sterk geïnnerveerd is, zijn deze niet-genezende hoornvlieszweren en terugkerende cornea-erosies zeer pijnlijk en verminderen ze de kwaliteit van leven van patiënten die ze ervarensterk 1.
Cel signalering
Wanneer een verder gezond hoornvlies gewond raakt, gaan calciumsignaleringsgebeurtenissen in de cellen naast de wond vooraf aan en leiden cellulaire migratie naar het wondbed, waar ze het letsel sluiten zonder het risico op littekens 2,3. Deze signaleringsgebeurtenissen zijn goed gekarakteriseerd in cornea-epitheelcelkweekmodellen met behulp van live cell imaging2. Voorlopige experimenten tonen significant meer calciumsignalering na verwonding in niet-diabetische cellen in vergelijking met diabetische cellen. De karakterisering van de celsignaleringsgebeurtenissen in ex vivo globes is echter een technische uitdaging gebleken.
Live cel beeldvorming
Eerdere studies hebben met succes calciumsignaleringsgebeurtenissen geregistreerd uit in vitro celkweekmodellen van corneawondgenezing 4,5,6. Het ontwikkelen van een methodologie om beelden van hoge kwaliteit te produceren van deze signaleringsgebeurtenissen in ex vivo weefsel is van groot belang omdat het de studie van deze gebeurtenissen in een complexer en levensecht systeem mogelijk zou maken. Eerdere benaderingen betroffen dissectie van het hoornvlies gevolgd door immobilisatie in een UV-geïnduceerde PEG-gel 7,8,9. Immobilisatie is een essentiële maar uitdagende stap bij het werken met levend weefsel, omdat het levensvatbaar en gehydrateerd moet blijven in de loop van het experiment. Bovendien mag immobilisatie het weefsel niet beschadigen. Hoewel de PEG-oplossing het weefsel immobiliseerde, waren de resolutie en kwaliteit van de geproduceerde beelden niet consistent. Daarom zijn 3D-geprinte houders ontwikkeld om intacte bollen te immobiliseren om beelden van hogere kwaliteit te produceren met minder risico op weefselschade.
De aanpak
Een unieke 3D-geprinte houder werd ontwikkeld om intacte ex vivo globes te immobiliseren voor live cell imaging. Deze houder voorkomt schade door twee belangrijke bronnen: het maakt beeldvorming van een enucleated bol mogelijk zonder de noodzaak om het hoornvlies te ontleden, en het elimineert blootstelling aan UV-licht. Zonder deze bronnen van schade gaven de verkregen beelden nauwkeuriger de reactie weer op de krasblessures die experimenteel werden gemaakt. Bovendien werd de 3D-geprinte houder gekalibreerd op de precieze afmetingen van het muizenoog. Dit zorgde voor een veel betere pasvorm dan immobilisatie in peg-oplossing, wat leidde tot een beeld van hogere kwaliteit bij lagere vermogens als gevolg van verminderde weefselbeweging. Een afdekbalk die aan de bovenkant van de houder is bevestigd, zorgt ervoor dat de wereldbol gedurende de hele duur van het experiment onbeweeglijk blijft en dat er geen verplaatsing van de aardbol plaatsvindt wanneer groeimedia worden aangebracht om de hydratatie en levensvatbaarheid te behouden. De mogelijkheid om de houder op precieze afmetingen te printen, stelt ons ook in staat om een optimale pasvorm te genereren voor muizenogen van verschillende groottes vanwege de leeftijd of ziektestatus. Deze technologie kan breder worden toegepast om houders voor de ogen van verschillende soorten te ontwikkelen op basis van hun afmetingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een live cell imaging-techniek die een 3D-geprinte houder gebruikt om intacte dierenogen te stabiliseren en te immobiliseren. Het is ontworpen om verschillende belangrijke nadelen te omzeilen die worden erkend met eerdere live cell imaging-protocollen van ex vivo hoornvliesweefsel. Dit protocol biedt veel voordelen voor de live cell imaging van intacte globes. Het vermindert aanzienlijk onnodige weefselschade die de wondgenezingsreactie op experimenteel geïnduceerde kraswonden zou kunnen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de NIH bedanken voor de volgende subsidiesteun: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) en 5T32GM008541-24 (KS). We willen ook het Massachusetts Lions Eye Research Fund en het New England Corneal Transplant Fund erkennen.
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
Referências
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengenharia. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
