組換えGタンパク質共役型受容体のハイスループットスクリーニングのための「二重付加」カルシウム蛍光アッセイ
Summary
この研究では、組換えGタンパク質共役受容体(GPCR)上の低分子ライブラリをスクリーニングするための384ウェルプレートのハイスループット細胞内カルシウム蛍光アッセイについて説明します。標的は、牛熱ダニ由来のキニン受容体である リピケファルス・マイクロプラスが、 CHO-K1細胞で発現している。このアッセイは、1つの「二重付加」アッセイで同じ細胞を使用するアゴニストとアンタゴニストを同定する。
Abstract
Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、受容体の最大のスーパーファミリーであり、多くのヒト薬物の標的となっています。GPCRに対するランダム低分子ライブラリーのハイスループットスクリーニング(HTS)は、製薬業界で標的特異的創薬に使用されています。この研究では、HTSを使用して、無脊椎動物特異的神経ペプチドGPCRの新規低分子リガンドを、致命的なヒトおよび獣医病原体のベクターの生理学的研究のためのプローブとして同定しました。
無脊椎動物特異的キニン受容体は、利尿、摂食、消化など、無脊椎動物の多くの重要な生理学的プロセスを調節するため、標的として選択されました。さらに、多くの無脊椎動物GPCRの薬理学は、十分に特徴付けられていないか、まったく特徴付けられていません。したがって、他の後生動物、特にヒトにおける関連するGPCRに関するこれらの受容体群の鑑別薬理学は、スーパーファミリーとしてのGPCRの構造活性関係に知識を追加します。HTSアッセイは、ウシコレラダニまたはミナミウシマダニ、 Rhipicephalus microplusからのキニン受容体のリガンドの発見のために、384ウェルプレート中の細胞用に開発されました。このダニキニン受容体はCHO-K1細胞で安定に発現していた。
キニン受容体は、内因性キニン神経ペプチドまたは他の小分子アゴニストによって活性化されると、カルシウム貯蔵から細胞質へのCa2+ 放出を引き起こす。「二重付加」アプローチと組み合わせたこのカルシウム蛍光アッセイは、同じアッセイプレート内の機能的アゴニストおよびアンタゴニスト「ヒット」分子を検出することができます。各アッセイは、320個のランダムな小分子のアレイを担持した薬物プレートを用いて実施した。0.7の信頼性の高いZ’因子が得られ、HTSが2μMの最終濃度にあるときに3つのアゴニストヒット分子と2つのアンタゴニストヒット分子が同定されました。ここで報告されるカルシウム蛍光アッセイは、Ca2+ シグナル伝達カスケードを活性化する他のGPCRをスクリーニングするように適合させることができる。
Introduction
酵母からヒトに存在するGタンパク質共役型受容体(GPCR)は、多くの生物において受容体の最大のスーパーファミリーを表しています1。それらは、動物のほぼすべての生物学的プロセスを調節する上で重要な役割を果たします。節足動物のゲノムには50〜200個のGPCRがあり、それらは最大の膜受容体スーパーファミリー2を表しています。それらは、配列の類似性と関数に基づいて、6つの主要なクラス、A〜Fに分類されます3。GPCRは、ホルモン、神経ペプチド、生体アミン、グルタミン酸、プロトン、リポ糖タンパク質、光子など、さまざまな細胞外シグナルを伝達します4。GPCRはヘテロ三量体Gタンパク質(Gα、Gβ、およびGγ)に結合して、下流のシグナルを伝達します。GαsまたはGαi/oタンパク質に結合したGPCRは、アデニリルシクラーゼを活性化または阻害することにより、細胞内の3′,5′-サイクリックアデノシン一リン酸(cAMP)レベルをそれぞれ増加または減少させます。Gαq/11に結合したGPCRは、ホスホリパーゼC(PLC)-イノシトール-1,4,5-三リン酸(IP3)経路を活性化することにより、小胞体カルシウム貯蔵部からのカルシウム放出を誘導します。Gα12/13に結合したGPCRは、RhoGTPaseヌクレオチド交換因子5,6を活性化します。GPCRは、ヒトの薬物の50%以上と殺ダニ剤であるアミトラズ4の標的です。GPCRはこのような多様なシグナルを伝達するため、無脊椎動物特有の生理機能を破壊する新規農薬の開発の標的として期待されています。
HTSの目標は、受容体機能を調節できるヒット分子を特定することです。HTSには、アッセイ開発、小型化、自動化が含まれます7。節足動物の神経ペプチドGPCRは、発生、脱皮および異質、排泄、エネルギー動員、生殖など、ほとんどの生理学的機能に関与しています4。節足動物および後生動物の神経ペプチドGPCRのほとんどは、黒脚ダニIxodes scapularisの筋抑制ペプチドおよびSIFamide受容体など、カルシウムシグナル伝達カスケード2,6,8,9,10を介してシグナル伝達する。それらのリガンドは後腸運動アッセイにおいて拮抗的であり、SIFは収縮を誘発し、MIPはそれを阻害する11,12。黄熱病の蚊のNPY様受容体であるネッタイシマカは、13を求める女性の宿主を調節します。エクオリンカルシウム生物発光アッセイ14などの他の代替カルシウム動員アッセイと比較して、カルシウム蛍光アッセイは実行が容易であり、他の組換えカルシウム検出タンパク質のトランスフェクションを必要とせず、費用効果が高い。カルシウム蛍光アッセイは、エクオリンカルシウム生物発光アッセイ14、15で得られた高速速度論的シグナルと比較して延長シグナルを生成する。
この例では、牛熱ダニ由来のキニン受容体であるリピセファルスマイクロプラスをCHO-K1細胞株で組換え発現させ、カルシウム蛍光アッセイに使用しました。R.マイクロプラスに見られるキニン受容体遺伝子は1つだけです。受容体は、Gqタンパク質依存性シグナル伝達経路を介してシグナルを送り、カルシウム貯蔵から細胞内空間16へのCa2+の流出を引き起こす。このプロセスは、カルシウムイオンと結合すると蛍光シグナルを誘発する蛍光色素によって検出および定量できます(図1)。
キニン受容体は無脊椎動物特異的GPCRであり、クラスAロドプシン様受容体に属する。キニンは、軟体動物、甲殻類、昆虫、およびアカリに存在する古代のシグナル伝達神経ペプチドです4,17,18。鞘翅目(甲虫)はキニンシグナル伝達システムを欠いています。蚊のネッタイシマカでは、3つのエデスキニンに結合するキニン受容体は1つだけですが、ショウジョウバエメラノガスターは、ドロソキニンを固有のリガンドとして持つキニン受容体を1つ持っています19,20,21。脊椎動物には相同なキニンやキニン受容体はありません。キニンの正確な機能はダニでは不明ですが、R. microplusのキニン受容体RNAiサイレンシングされた雌は、生殖適応度が大幅に低下しています22。キニンは昆虫の多面性ペプチドです。ショウジョウバエメラノガスターでは、それらは中枢および末梢神経調節系23、前泄化24、摂食25、代謝26、および睡眠活動パターン26,27、ならびに幼虫の移動28の両方に関与している。キニンは、蚊A.エジプト29,30,31の後腸収縮、利尿、および摂食を調節します。キニンペプチドは、保存されたC末端ペンタペプチドPhe−X1−X2−Trp−Gly−NH2を有し、これは生物学的活性32のために必要最小限の配列である。節足動物の特異性、内因性リガンドのサイズが小さいため、低分子干渉を受けやすいこと、および昆虫の多面的機能により、キニン受容体は害虫駆除の有望な標的となっています4。
「二重付加」アッセイ(図2)は、同じHTSアッセイ15におけるアゴニストまたはアンタゴニストの同定を可能にする。これは、創薬のために製薬業界で一般的に使用されている「二重付加」アッセイから適応されています33。簡単に言えば、細胞プレートへの薬物の最初の添加は、溶媒制御の適用と比較してより高い蛍光シグナルが検出されたときに、化学ライブラリー内の潜在的なアゴニストの同定を可能にする。これらの小分子とのインキュベーションの5分後、既知のアゴニスト(キニンペプチド)をすべてのウェルに適用します。薬物プレートからアンタゴニストを無作為に受けたウェルは、最初の添加で溶媒を受け取ったコントロールウェルと比較して、アゴニスト添加時に低い蛍光シグナルを示します。次いで、このアッセイは、同じ細胞を有する潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストの同定を可能にする。標準的なHTSプロジェクトでは、これらのヒット分子は、用量反応アッセイおよび追加の生物学的活性アッセイによってさらに検証されますが、ここには示されていません。
図1:カルシウム蛍光アッセイ機構の説明図。Gqタンパク質は、細胞内カルシウムシグナル伝達経路をトリガーします。キニン受容体(Gタンパク質共役型受容体)をCHO-K1細胞で組換え発現させた。アゴニストリガンドが受容体に結合すると、キニン受容体に関連するGqタンパク質がPLCを活性化し、これがPIP2分子のIP3およびDAGへの変換を触媒する。次に、IP 3は小胞体表面のIP3 Rに結合し、Ca2+が細胞質に放出され、そこでCa2+イオンが蛍光色素に結合して蛍光シグナルを誘発します。蛍光シグナルは、490 nmでの励起によって得られ、514 nmで検出されます。略語:GPCR = Gタンパク質共役型受容体;PLC = ホスホリパーゼC;PIP2=ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸;IP3 =イノシトール三リン酸;DAG =ジアシルグリセロール;IP3 R = IP3受容体。BioRender.com で作成。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:CHO-K1細胞で発現するGタンパク質共役型受容体上の低分子のハイスループットスクリーニングのワークフロー。 (A)キニン受容体を安定に発現する組換えCHO-K1細胞を、リキッドハンドリングシステム(25μL/ウェル)を用いて384ウェルプレート(10,000細胞/ウェル)に添加し、加湿したCO2インキュベーターで12〜16時間インキュベートした(B)蛍光色素を含むアッセイバッファー(25 μL/ウェル)を、リキッドハンドリングシステムを使用して細胞プレートに加えました。プレートを37°Cで30分間インキュベートし、RTでさらに30分間平衡化した。 (C)各ウェル内の細胞のバックグラウンド蛍光シグナルをプレートリーダーで測定した。(D)384ウェルライブラリープレートからの薬物溶液とブランク溶媒(すべて0.5 μL/ウェル)を、リキッドハンドリングシステムを使用して細胞アッセイプレートに加えました。(E)細胞性カルシウム蛍光応答は、薬物溶液の添加直後にプレートリーダーで測定され、平均よりも高い蛍光シグナルを惹起する化合物をアゴニストヒットとして選択した。GPCRをブロックするアンタゴニストヒット(下のアイコン)は、ステップGの間にペプチドアゴニストを添加した後に明らかにされた。(f)同じアッセイプレートにおいて、スクリーニング化合物と共に細胞を5分間インキュベートした後、ダニキニン受容体の内因性アゴニストペプチドRhimi-K-1(QFSPWGamide)を各ウェル(1μM)に添加した。(g)アゴニストペプチド添加後の細胞蛍光応答を直ちにプレートリーダーにより測定した。蛍光シグナルを阻害する化合物をアンタゴニストヒットとして選択した。略語:GPCR = Gタンパク質共役型受容体;RT =室温;RFU = 相対蛍光単位。BioRender.com で作成。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
HTSの目標は、膨大な数の低分子をスクリーニングすることにより、ヒット分子を特定することです。したがって、この例の結果は、従来のHTS実験のごく一部にすぎません。さらに、同定されたヒット分子は、同じ組換え細胞株および空のベクターのみを保持するCHO-K1細胞株での用量依存アッセイなどのダウンストリームアッセイで検証する必要があり、小分子を保存するために同時に実行で?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-being賞(賞番号2022-67015-36336、PVP [プロジェクトディレクター])およびTexas A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program(FY’22-23)からP.V.P.への競争的資金から支援されました。 農業生命科学部TAMUのA.W.E.S.O.M.E.教員グループは、原稿の編集を支援したことで認められています。 補足表S2 には、テキサスA&M大学のJames Sacchettini博士の研究室とTexas A&M AgriLife Researchから入手した社内のランダム低分子ライブラリからのデータが含まれています。
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco Invitrogen | 15050-065 | with phenol red |
| 0.4% trypan blue | MilliporeSigma | T8154 | liquid, sterile |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes |
| 5 mL serological pipette | Corning | 29443-045 | Corning Costar Stripette individually wrapped |
| 10 mL serological pipette | Corning | 29443-047 | Corning Costar Stripette individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352196 | sterile |
| 20 µL filter tips | USA Scientifc Inc. | P1121 | sterile, barrier |
| 25 mL serological pipette | Corning | 29443-049 | Corning Costar Stripette individually wrapped |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430828 | graduated, sterile |
| 150 mL auto-friendly reservior | Integra Bioscience | 6317 | sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1 |
| 150 mL auto-friendly reservior | Integra Bioscience | 6318 | sterile, stacked, for loading dye in day 2 |
| 384/ 12.5 µL low retention tips | Integra Bioscience | 6405 | long, sterile filter |
| 384/ 12.5 µL tips | Integra Bioscience | 6404 | long, sterile filter |
| 384-well plate | Greiner | 781091 | CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat |
| Aluminum plate seals | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | polyester-based |
| Aluminum foil wrap | Walmart | ||
| Biosafty cabinet II | NuAire | NU-540-300 | |
| Cell counter | Nexcelom | AutoT4 | |
| cell counting slides | Nexcelom | SD-100 | 20 µL chamber |
| CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Forma Series II | |
| Desk Lamp | SunvaleeyTEK | RS1000B | |
| Dimethyl sulfoxide | MilliporeSigma | 276855 | anhydous, >99.9% |
| Drug plate | Corning | 3680 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CV | DPBS, 1x without calcium amd magnesium |
| Ethanol | Koptec | 2000 | |
| F-12K Nutrient Mixture | Corning | 45000-354 | (Kaighn's Mod.) with L-glutamine |
| Fetal bovine serum | Equitech-Bio | SFBU30 | |
| Fluorescent calcium assay kit | ENZO Lifescience | ENZ-51017 | 10×96 tests |
| G418 sulfate | Gibco Invitrogen | 10131-027 | Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL |
| Hank's buffer | MilliporeSigma | 55037C | HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read |
| HEPES buffer | Gibco Invitrogen | 15630-080 | 1 Molar |
| HTS data storage plateform | CDD vault | https://www.collaborativedrug.com/ | |
| Liquid handling system | Integra Bioscience | Viaflo | 384/12.5 µL |
| Plate centrifuge | Thermo Fisher | Sorvall ST8 | |
| Plate reader | BMG technology | Clariostar | |
| Poly-D-lysine | MilliporeSigma | P6407 | |
| Rhimi-K-1 agonist peptide | Genscript | custom order | QFSPWGamide |
| T-75 flask | Falcon | 353136 |
Referências
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