Microcampionamento nell'analisi mirata delle proteine basate sulla spettrometria di massa di proteine a bassa abbondanza
Summary
Viene presentato un protocollo per la determinazione di biomarcatori a bassa abbondanza da campioni di siero essiccati esemplificati con il peptide di rilascio della progastrina biomarcatore (ProGRP). Le sfere magnetiche rivestite di anticorpi sono utilizzate per la pulizia selettiva e l’arricchimento di un peptide ProGRP proteotipico. Il peptide catturato viene successivamente analizzato mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem.
Abstract
Questo articolo presenta un protocollo con descrizioni dettagliate per un’efficiente pulizia dei campioni di proteine a bassa abbondanza da campioni essiccati. Questo viene eseguito utilizzando la proteolisi basata su perline prima della determinazione della cattura dell’affinità del peptide proteotipico e della spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida (LC-MS / MS). La procedura può essere applicata sia a campioni essiccati convenzionali utilizzando schede cartacee (ad esempio, macchie di sangue essiccato [DBS] e macchie di siero essiccato [DSS]), sia a campioni raccolti con metodi di campionamento più recenti come il microcampionamento volumetrico assorbente (VAMS). Oltre a descrivere questa procedura, la preparazione di perle di tripsina e perline rivestite di anticorpi è presentata in modo passo-passo in questo lavoro. I vantaggi della procedura presentata sono la proteolisi efficiente in termini di tempo utilizzando perline e la pulizia robusta selettiva utilizzando l’acquisizione di affinità peptidica. L’attuale procedura descrive la determinazione del biomarcatore del carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC) a bassa abbondanza, peptide di rilascio della progastrina (ProGRP), nel siero essiccato (sia DSS che VAMS). Procedure dettagliate per la preparazione delle perline facilitano l’implementazione del flusso di lavoro in nuove applicazioni o altri laboratori. È dimostrato che i risultati possono dipendere dal materiale di campionamento; per il presente progetto, sono state osservate intensità di segnale più elevate per i campioni raccolti utilizzando VAMS rispetto ai DSS.
Introduction
Il microcampionamento esiste da oltre 100 anni da quando Ivar Bang ha descritto il monitoraggio del glucosio dalle DBS nel 19131. Dopo che Guthrie e Susi hanno introdotto le DBS nel 1963 per la determinazione della fenilalanina nei neonati2, la tecnica è diventata sempre più diffusa. I primi rapporti di DBS per il campionamento e la conservazione delle proteine sono stati fatti nei primi anni 19703,4, e un decennio dopo, nel 1980, abbiamo trovato il primo rapporto di spettrometria di massa (MS) per la determinazione delle proteine da DBS5. Nonostante questa introduzione precoce, è stato solo dopo la fine del secolo che la determinazione della SM delle proteine da DBS e altre tecniche di microcampionamento è diventata più diffusa.
In un contesto clinico, è interessante determinare le proteine nella diagnosi e nel follow-up delle malattie, nonché per il monitoraggio del trattamento e scopi di doping. Questa determinazione mirata degli analiti proteici da parte della SM da piccole quantità di campioni essiccati è ancora impegnativa e spesso richiede un’ampia preparazione del campione prima dell’analisi.
La determinazione quantitativa mirata delle proteine da parte della SM viene comunemente eseguita applicando l’approccio bottom-up, digerendo le proteine ai peptidi prima dell’analisi. Questa procedura produce una miriade di peptidi, il che rende difficile l’analisi diretta del campione biologico digerito. Un modo per aggirare questo è applicare una fase di pulizia dell’affinità selettiva prima dell’analisi della SM prima o dopo la digestione 6,7,8. In questo modo, la proteina di interesse (o il suo peptide proteotipico, se la fase di cattura dell’affinità viene eseguita dopo la digestione) viene isolata selettivamente dalla matrice del campione prima dell’analisi, fornendo limiti di rilevazione inferiori9.
Il microcampionamento con schede DBS presenta alcuni vantaggi rispetto ai campioni di sangue convenzionali, tra cui un basso volume di campione, un campionamento meno invasivo e una maggiore stabilità di conservazione. Tuttavia, la matrice del campione è diversa e può introdurre altre sfide nell’analisi (ad esempio, matrice del campione essiccata rispetto alla matrice del campione liquido e sangue capillare rispetto al siero o al plasma)10,11. Un’altra sfida che si osserva con le DBS è il cosiddetto effetto ematocrito, in cui l’ematocrito del sangue colpisce il volume del campione ulteriormente elaborato per l’analisi e quindi introduce variabilità interindividuale nell’analisi12. Le unità di microcampionamento più recenti, come VAMS introdotte nel 201413, affrontano questo problema raccogliendo un volume fisso di sangue invece di una goccia di sangue.
Questo protocollo descrive una configurazione per l’analisi di biomarcatori a bassa abbondanza da microcampioni essiccati. Dopo l’eluizione, il campione essiccato viene digerito e, successivamente, il peptide proteotipico viene isolato mediante cattura dell’affinità peptidica. L’analita modello è il biomarcatore SCLC ProGRP. Poiché ProGRP non può essere determinato in modo affidabile dal sangue intero, il siero è stato utilizzato come matrice del campione. Vengono mostrati i risultati rappresentativi sia dei DSS che dei campioni di siero raccolti utilizzando VAMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto contiene informazioni su come condurre diversi passaggi importanti nell’analisi di biomarcatori a bassa abbondanza da microcampioni essiccati (DSS e VAMS), compresa la preparazione di perle di tripsina e perle magnetiche rivestite di anticorpi. Sulla base dell’esperienza precedente, trattiamo sempre l’anticorpo con acido prima dell’immobilizzazione delle sfere per migliorare l’orientamento degli anticorpi15.
Uno dei passaggi critici di questa procedura è la selezione del formato di microcampionamento più adatto. In primo luogo, si deve considerare se l’analita in questione può essere determinato dal sangue intero, o se la concentrazione è influenzata dalle cellule del sangue e deve essere determinata nel siero o nel plasma (come per l’analita modello, ProGRP).
Entrambi gli approcci basati su carta e polimeri presentano vantaggi e limiti; per ProGRP, VAMS offre un chiaro vantaggio rispetto al recupero dell’analita dopo l’estrazione dal campionatore. Tuttavia, questo può probabilmente essere ottimizzato utilizzando una soluzione di estrazione diversa per i campioni DSS. Tuttavia, questa potenziale interazione tra l’analita e il materiale di campionamento è importante da prendere in considerazione in quanto potrebbe comportare una maggiore variazione analitica e limiti di rivelazione più elevati. Poiché l’IS utilizzato è un peptide SIL e aggiunto per la prima volta dopo la digestione, IS corregge le fasi successive alla digestione (ad esempio, estrazione di affinità e analisi LC-MS / MS). La correzione IS non è possibile per l’estrazione da DSS/VAMS e la fase di digestione.
Nella procedura vengono utilizzati due tipi di perle: perle di tripsina per la digestione dopo l’estrazione del campione di siero dal campionatore e perle magnetiche rivestite di anticorpi per la cattura del peptide proteotipico dopo la digestione. Uno dei motivi principali per l’utilizzo di perle di tripsina, oltre ad accelerare la digestione, è quello di ridurre al minimo l’attività residua della tripsina nel campione durante la cattura dell’affinità. Questo è importante per evitare la proteolisi triptica del mAb durante la cattura di affinità.
Le perle di agarosio sono state utilizzate per la preparazione delle perle di tripsina, mentre le perle magnetiche sono state utilizzate per la preparazione delle perle rivestite di anticorpi. Le perle di agarosio sono meno costose delle perle magnetiche, ma hanno una limitazione che la separazione delle perle dalla soluzione richiede la centrifugazione. Ciò rende la separazione di perline e surnatante meno efficiente rispetto a quando si utilizzano perline magnetiche. Inoltre, l’automazione del flusso di lavoro è difficile utilizzando perline di agarosio. Tuttavia, sono disponibili perline magnetiche attivate dal NHS che possono essere utilizzate per un flusso di lavoro di preparazione dei campioni più snello e automatizzabile.
Il microcampionamento è una tendenza importante nella bioanalisi sia dei farmaci che dei biomarcatori. Una sfida con l’approccio attuale è la quantità limitata di volume del campione (10 μL), che può essere di particolare importanza nella determinazione di analiti di abbondanza molto bassa come ProGRP (pg / mL-basso ng / mL livello). Tuttavia, questa sfida può essere aggirata utilizzando apparecchiature analitiche all’avanguardia. Per questi analiti a bassa abbondanza, la scelta della preparazione del campione è fondamentale e la pulizia selettiva del campione attraverso la cattura di affinità basata sugli anticorpi è spesso necessaria. Poiché è stato dimostrato che la cattura peptidica fornisce estratti più puliti e limiti di rilevazione inferiori rispetto alla cattura proteica (utilizzando lo stesso anticorpo)14, il presente metodo si concentra su questo approccio in combinazione con il microcampionamento. Un altro vantaggio dell’approccio di cattura del peptide è che il peptide IS SIL corregge anche la fase di cattura dell’affinità.
In questo lavoro, un anticorpo mirato a una proteina è stato utilizzato per la cattura del peptide. Questo è un vantaggio in quanto la disponibilità di anticorpi pronti all’uso che prendono di mira le proteine è superiore rispetto agli anticorpi pronti all’uso che prendono di mira i peptidi proteotipici. Tuttavia, affinché un anticorpo antiproteico catturi in modo efficiente un peptide proteotipico, l’epitopo deve essere intatto dopo la digestione delle proteine. Inoltre, per molti anticorpi, l’epitopo esatto non è noto, rendendo noiosa la ricerca di un anticorpo anti-proteina. Ciò limita il numero di anticorpi anti-proteine disponibili applicabili per la cattura peptidica. La procedura descritta è dimostrata utilizzando il siero come matrice e ProGRP come analita bersaglio. La procedura è destinata ad essere applicabile ad altre matrici e ad altri analiti target. Invece di utilizzare un anticorpo anti-proteina disponibile in commercio per la cattura di affinità del peptide proteotipico, è possibile utilizzare anche anticorpi anti-peptidici personalizzati. L’efficienza di pulizia della cattura peptidica rispetto alla cattura proteica è illustrata nella Figura 5. Sostituendo le perle di agarosio utilizzate per la preparazione delle perle di tripsina con perle magnetiche, la procedura dovrebbe anche essere compatibile con le stazioni di lavoro robotizzate per la preparazione dei campioni sul mercato.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo vivamente la Prof.ssa Elisabeth Paus del Norwegian Radium Hospital (Oslo University Hospital, Oslo, Norvegia) per aver fornito lo standard ProGRP e l’anticorpo monoclonale anti-ProGRP, M18. La tassa di pubblicazione è stata coperta da una sovvenzione di Apoteker Harald Conrad Thaulows legat. Trine Grønhaug Halvorsen e Léon Reubsaet sono partner del consorzio National Network of Advanced Proteomics Infrastructure (NAPI), finanziato dal programma INFRASTRUKTUR del Consiglio norvegese di ricerca (numero di progetto: 295910).
Materials
| Acetic acid N-hydroxysuccinimide ester | Carbosynt (Staad, Switzerland) | FA33719 | Store in freezer below -20 °C |
| ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%) |
Innovagen (Lund, Sweden) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Ammonium bicarbonate BioUltra (≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 09830-500G | |
| Aquasil C18 column, 3 µm, 50 mm x 1 mm | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | 77503-051030 | Analytical column compatible with 100% aqueous mobile phase |
| Benzamidine (≥ 95.0% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 12072 | Store in fridge at 2-6 °C |
| Calsium chloride dihydrate (≥ 99% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 223506-500G | |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 5804000010 | |
| Cloned ProGRP isoform 1 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Disodium hydrogenphosphate dihydrate (pro analysis) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 30435-500G | |
| Disodium hydrogenphosphate dodecahydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06579.0500 | |
| Dynabeads M-280 tosylactivated 10 mL | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 14204 | Store in fridge at 2-6 °C |
| DynaMag-2 | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 123-21D | |
| Ethanolamine (pro analysis, ≥ 99%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | #02400 | |
| Formic acid (≥ 99% ) for LC-MS | VWR International (Radnor, PA, USA) | 84865.260 | |
| FTA DMPK-C cellulose card | Whatman (Kent, UK) | WB129243 | DBS card |
| HPLC vials, clear glass, 1.5 mL, 32 x 11.6 mm, Clean Pack | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 11 09 0519 | |
| Hulamixer sample mixer | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 101561503016 | Sample mixer with end-over-end mixing and reciprocal rotation and vibration |
| Human serum from healty blood donors | Bloodbank, Ullevål, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Hydrochloric acid fuming 37% (Emsure for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00317.1000 | |
| LC-MS/MS system: Ultimate 3000 system (Autosampler, WPS-3000TRS; Micropump, LPG-3400M; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) and TSQ Quantum access. Controlled by Xcalibur 2.2 SP1.48 | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | Not applicable | |
| LiChrosolv Acetonitrile hypergrade for LC-MS | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00029.2500 | |
| LL Biotrode, Combined glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0224.100 | |
| Magnetic stirrer, Type M10 | Franz Morat KG (Eisenbach, Germany) | 10236 | |
| Micro inserts, glass (31 x 6 mm, 0.1 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 548-0006 | |
| MilliQ integral 3 with Q-POD | Merck Millipore (Molsheim, France) | ZRXQ003T0 | For production of Type 1 water |
| monoclonal antibody M18 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in fridge at 2-6 °C |
| Neoteryx Mitra microsampler (10 μL) 4 sampler Clamshell | Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | NC1382947 | |
| NHS-activated sepharose beads 4 fast flow | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | GE17-0906-01 | Agarose beads, store in fridge at 2-6 °C |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 613-2911 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790012 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 1,000 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 791002 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 200 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790202 | |
| pH glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0233.100 | |
| pH meter 744 | Metrohm (Herisau, Sveits) | 8.744.1003 | |
| Pipet 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725090 | |
| Pipet m10 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725020 | |
| Pipet m100 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725050 | |
| Pipet m1,000 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725070 | |
| Pipet m20 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725030 | |
| Potassium chloride (KCl ≥ 99.9%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P-3911 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.04873.0250 | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 0.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0133 (0030 108.094) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0132 (0030 108.116) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 2.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0134 (0030 108.450) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 5.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0792 (0030108.302) | |
| Scissors | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | Z186716-1EA | |
| Sodium azide (BioUltra; ≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 71289-5G | |
| Sodium chloride (for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06404.1000 | |
| Sodium dihydrogenphosphate monohydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06346.0500 | |
| Sodium hydroxide (AnalaR NORMAPUR) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 28244.295 | |
| Sodium tetraborate decahydrate (≥ 99. %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S9640-500G | |
| Spectrafuge Mini Centrifuge | LABNET International (Edison, NJ, USA) | C1301 | |
| Stirring magnet, 25 mm x 6 mm Ø, circular | Leybold (Cologne, Germany) | 666 851 | |
| Stuart Scientific SA8 vortex mixer | Stuart (Staffordshire, UK) | Z648531-1EA | |
| SuperClear centrifuge tubes (15 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0150 | |
| SuperClear centrifuge tubes (50 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0155 | |
| Thermomixer comfort 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 53,55,27,831 | Temperature controlled mixer |
| Trizma base (reagent grade, ≥ 99.0 %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T6066 | Tris(hydroxymethyl)aminometan (tris) |
| Trizma HCl (reagent grade, ≥ 99.0%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T3253-100G | Tris(hydroxymethyl)aminometan HCl (tris HCl) |
| Trypsin (TCPK-treated from bovine pancreas, 10,000-15,000 BAEE units/mg Protein) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T8802 | Store in freezer below -20 °C |
| Tween 20 | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P7949-500ML | polysorbate 20 |
| Tweezers | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | TEM-78511-27 | |
| Vial caps, white, 9 mm | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 09 15 0981 | |
| Mitra microsampler with VAMS (Volumetric adsorptive microsampling) technology, 10 µL, 4-sampler clamshell | Neoteryx (Torrance, CA, USA) |
Referências
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