마우스 난모세포에서 세포질 미세소관 조직 센터의 다광자 레이저 제거

여기에 설명 된 모든 방법은 미주리 대학교 (동물 관리 품질 보증 참조 번호 9695)의 승인을 받았습니다. Cep192-eGFP 리포터 6-8주령의 암컷 마우스를 본 연구에 사용하였다. Cep192-eGFP 리포터 마우스를 생성하기 위해, CRISPR/Cas9-매개 상동성-지향 복구를 사용하여 EGFP 리포터 유전자를 CF-1 마우스 게놈 내로 통합하였다. EGFP 리포터는 Cep192(MTOC의 필수 구성 요소)15의 C-말단에서 융합되었습니다. 마우스 콜로니를 유지하기 위해, 동형접합체 Cep192-eGfp 리포터 마우스를 사용하였다. 모든 동물은 21 ° C 및 55 % 습도의 케이지 (최대 4 마리 동물 / 케이지)에서 유지되었으며, 12 시간의 명암 사이클과 음식과 물에 대한 자유로운 접근이 이루어졌습니다. 1. 마우스 난모세포 수집 배양 배지(Chatot, Ziomek, 및 Bavister, CZB19, 재료 표 참조)를 준비하고, 이를 37°C 및 5%CO2 에서 밤새 배양하였다.참고: CZB 배지는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다(배지 구성에 대한 보충 파일 1 참조). CZB 배지에 글루타민 (1mM)과 밀리논 (2.5mM) (CZB + M) ( 재료 표 참조)을 보충하고 인큐베이터에 넣습니다.참고: 밀리논은 전단계 I에서 정지된 난모세포를 유지하고 감수 분열 재개20을 예방하는 포스포디에스테라제 억제제입니다. 3mg/mL 폴리비닐피롤리돈(PVP), 25mM hepes(pH 7.3)(보충 파일 1) 및 밀리논(2.5mM)(MEM/PVP + M, 재료 표 참조)을 포함하는 수집 배지(중탄산염이 없는 최소 필수 배지, MEM)를 준비합니다. 수집 및 배양 접시를 준비하고 60mm 및 35mm 페트리 접시에 각각 4개의 마이크로방울(100μL)의 수집 배지(MEM/PVP + M)와 2개의 마이크로방울(CZB+M) 배지(CZB+M)를 만들고 미네랄 오일로 덮습니다( 재료 표 참조). 수집 접시를 슬라이드 상에 따뜻하게 유지하고, 배양 접시를 37°C 및 5%CO2에서 배양기에 넣는다. 난모세포 채취 44-48시간 전에 성적으로 성숙한(6-8주령) Cep192-eGFP 리포터 암컷 마우스에 임신한 암말의 혈청 성선 자극호르몬(PMSG, 재료 표 참조) 5IU를 복강 주사합니다. 자궁 경부 탈구로 마우스를 희생시키고, 난소21을 확인 및 제거하고, 37 ° C에서 예열 된 수집 배지 (MEM / PVP + M)가 들어있는 시계 유리로 옮깁니다. 시계 유리 바닥에 1mL 주사기를 대고 함께 묶인 재봉 바늘을 사용하여 여러 번(난소당 ~40회) 구멍을 뚫어 난모세포를 배지로 방출하여 난소를 고정합니다. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 단계 1.7의 적운-난모세포 복합체(COC)가 포함된 모든 배지를 빈 100mm 플라스틱 페트리 접시에 옮깁니다. 실체 현미경으로 파스퇴르 유리 피펫을 사용하여 COC를 수집하고 MEM/PVP + M이 포함된 수집 접시로 옮깁니다. 좁은 파스퇴르 유리 피펫(직경 약 100μm)을 사용하여 부드럽고 반복적인 피펫팅으로 난모세포를 기계적으로 탈퇴시킨 다음 CZB+M 배양 접시로 옮기기 전에 (100μL) MEM/PVP + M(수집 접시)의 4개 마이크로드롭으로 옮기고 세척합니다. 탈질된 난모세포를 공기 중의 5%의CO2 와 함께 37°C에서 1시간 동안 배양한다. 2. 난모세포 미세주입 250μL 떨어뜨린 MEM/PVP + M을 100mm 플라스틱 페트리 접시 뚜껑에 넣고 미네랄 오일로 덮습니다.알림: 페트리 접시 덮개에는 마이크로 매니퓰레이터를 조정할 수 있는 더 많은 공간을 제공하는 하단 림이 있습니다. 미세 주입 시스템을 켭니다 ( 재료 표 참조). 현미경의 온난화 단계(37°C)에 미세 주입 접시를 놓습니다. 마이크로로더 피펫 팁(재료 표 참조)을 사용하여 0.5μL의 mCh-Cep192cRNA를 주사 바늘에 로드하고 주사 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 고정합니다. 탈질된 난모세포(단계 1.11)를 250 μL 마이크로드롭(단계 2.1)으로 옮깁니다. 20x 또는 40x 대물 렌즈 아래에서 난모세포 위치에 따라 주사 바늘과 고정 바늘의 위치와 초점을 조정합니다(그림 1). 미세주입 장치를 설정하고 주입 압력(pi), 보상 압력(pc) 및 주입 시간(ti)을 5-10pl의 mCh-Cep192 cRNA를 주입할 수 있도록 설정합니다(MTOC를 외인성 표지하기 위해). 조심스럽게 핵을 건드리지 않고 난 모세포를 주입하십시오. 모든 난모세포가 주입되면 CZB+M의 3개의 마이크로드롭으로 세척하고 배양 접시(CZB+M)로 옮긴 다음 mCh-Cep192 발현을 허용하기 위해 37°C에서 3시간 동안 배양합니다. 3. 난모세포 성숙 적어도 3 시간 동안 공기 중 5%CO2 로 인큐베이터에서 미리 평형화된 CZB 배지에 글루타민(1 mM)을 첨가하여 성숙 배지를 준비한다. 35mm 페트리 접시에 두 개의 마이크로 방울 (100μL)의 성숙 배지를 만들고 미네랄 오일 (성숙 접시)로 덮으십시오. 100 μL 밀리논이 없는 CZB 마이크로드롭에서 프로상 I-체포된 난모세포를 최소 3회 세척하여 밀리논을 완전히 제거하고 감수 분열 재개를 허용합니다. 난 모세포를 성숙 접시로 옮기고 37 ° C의 공기 중에서 5 %CO2 로 가습 된 인큐베이터에서 5 시간 (prometaphase I 단계) 동안 배양합니다. 4. 절제 및 영상화를 위한 난모세포 제제 전구상 I 난모세포(단계 3.4)를 광유가 함유된 100μL의 성숙 배지(단계 3.1)를 함유하는 유리 바닥 배양 접시로 옮깁니다. 5. 절제를위한 현미경 준비 절제 최소 30분 전에 스테이지 인큐베이터의 온도 컨트롤러( 재료 표 참조)를 켜고 37°C로 설정합니다. CO2 컨트롤러를 켜고 5 % CO2로 설정하십시오. 40x 오일 이멀젼 아포크로매틱 대물렌즈를 선택하고 액침 오일을 소량 떨어뜨립니다. 난모세포가 있는 유리 바닥 배양 접시를 스테이지 탑 인큐베이터에 장착하고 인큐베이터를 가스 뚜껑으로 덮습니다. 이미지 수집 소프트웨어( 재료 표 참조)에서 여러 스테이지 위치를 저장할 수 있는 옵션을 선택합니다(예: “마크 정의 및 실험 찾기”). 투과광 명시야 조명을 사용하여 개별 난 모세포를 중심으로하고 위치를 저장합니다. 이미지 수집 소프트웨어에서 XYZ 스캔 모드를 선택하고 이미지 형식을 256 x 256 픽셀로 설정하고 줌 계수를 2.5x – 3.0x로 설정하고 스캔 주파수를 600Hz로 선택합니다. 이는 약 1.6μs의 픽셀 체류 시간에 해당합니다. 레이저 출력의 약 10%(샘플 레벨에서 4.0μW에 해당)에서 488nm 여기 레이저 라인을 설정하고( 재료 표 참조) 500-550nm의 스펙트럼 대역폭을 사용하여 MTOC의 GFP 신호를 관찰합니다. mCherry 태그가 붙은 Cep192에서 형광을 동시에 관찰하려면 레이저 출력의 약 8%(샘플 수준에서 10.7μW에 해당)에서 585nm 여기 레이저 라인을 설정하고 595-645nm의 스펙트럼 대역폭으로 설정된 다른 검출기를 사용합니다.참고: 난모세포 경계를 동시에 감지하기 위해 컨포칼 현미경의 투과광 검출기(TLD)를 사용하는 것이 좋습니다. 라이브 스캔 모드와 z-드라이브의 수동 제어를 사용하여 난모세포에서 MTOC를 스크리닝합니다. mcMTOC가 감지되면 그 주위에 정사각형 관심 영역(ROI)을 그립니다. 6. mcMTOC의 제거 펨토초 레이저를 740nm 파장으로 설정합니다.참고: 레이저 파장은 현미경과 레이저 조건에 따라 변경될 수 있습니다. 다광자 현미경의 전기 광학 변조기( 재료 표 참조)를 사용하여 레이저 출력을 샘플 평면에서 70-80mW 전력에 해당하는 60%-70%로 설정합니다.알림: 레이저에 펨토초 펄스 보상기가 장착된 경우 이를 사용하여 그룹 지연 분산(GDD)을 보정합니다. GDD 보정은 효율적인 mcMTOC 제거에 필요한 레이저 출력의 양을 줄이고 난 모세포의 광 손상을 최소화합니다. GDD 제어는 일반적으로 상용 다광자 현미경의 이미지 획득 소프트웨어와 통합됩니다. 5.6단계와 동일한 이미지 형식, 확대/축소 비율 및 스캔 빈도를 사용합니다. 선 및 프레임 평균 매개 변수를 1로 설정합니다. 소프트웨어에서 스캔 버튼을 클릭하여 선택한 ROI의 단일 레이저 스캔 을 수행하여 mcMTOC의 제거를 수행합니다. 5.7단계의 채널 설정을 사용하여 다광자 레이저 노출 전후에 촬영한 GFP 표지 구조의 이미지를 비교하여 제거 결과를 검토합니다. 절제가 성공하면 표적 mcMTOC에서 GFP 형광의 강도가 백그라운드에서 관찰된 수준으로 감소합니다. GFP-표지 구조의 일부 단편이 남아 있는 경우, mcMTOC의 다양한 z 평면에 초점을 맞추어 6.4단계를 한 번 이상 반복한다. 5.7단계의 채널 설정을 사용하여 mcMTOC 관련 mCherry 신호(mCh-Cep192)의 완전한 손실에 의한 제거 효율을 확인합니다. 난모세포의 모든 MTOC(다양한 초점면에서)가 제거될 때까지 5.8단계에서 6.7단계를 반복합니다.참고: 이 프로토콜은 다광자 레이저 노출 후 mcMTOC 고갈을 확인하고 GFP 광퇴색으로 인해 GFP 형광 손실이 발생할 가능성을 배제하기 위한 전략으로 mCh-Cep192 미세 주입을 사용합니다. 그러나 이 프로브의 미세 주입은 선택 사항이며 절제 절차에는 필요하지 않습니다.